不同浓度CB对小鼠纺锤体移...胞骨架及囊胚发育影响的研究_王启航.pdf

论著 收稿日期 基金项目 国家重点研发计划（）作者简介 王启航（），男，河北石家庄人，中国解放军总医院第七医学中心助理研究员，医学硕士，从事生殖医学临床及基础研究。通信作者。：不同浓度 对小鼠纺锤体移植后重构卵细胞骨架及囊胚发育影响的研究王启航，王伟，王伟周，商微（中国解放军总医院第七医学中心生殖医学科，北京 ；中国人民解放军总医院第六医学中心生殖中心，北京 ；中国人民解放军总医院第七医学中心妇产医学部，北京 ）摘要目的 探讨不同浓度细胞松弛素（，）对小鼠纺锤体移植后重构卵细胞骨架及胚胎发育的影响，筛选出更优的 浓度。方法 周的 雌鼠卵，使用常规剂量、低剂量、中剂量和高剂量的 做小鼠纺锤体移植，统计小鼠纺锤体移植效率；统计重构小鼠卵体外受精的（，）受精率、卵裂率、囊胚率、孵化率；对各组囊胚行免疫荧光染色，荧光显微镜观察计数；重构小鼠卵行免疫荧光染色，共聚焦显微镜观察细胞骨架并分析。结果低剂量组、中剂量组、高剂量组与常规组相比，小鼠纺锤体移植效率差异无统计学意义（）。高剂量组的受精率低于常规组（）；高剂量组的囊胚率、孵化率低于常规组、中剂量组（）。高剂量组的囊胚细胞总数少于常规组（），中剂量组的囊胚细胞总数多于常规组（）。低剂量组、中剂量组、高剂量组和常规组相比，不同时间重构小鼠卵微丝阳性比率差异无统计学意义（）；不同时间各组微丝的平均光密度值，组间比较差异有统计学意义（），时间点间比较差异有统计学意义（），组间的时间变化趋势差异有统计学意义（），即不同浓度 和不同观察时间对小鼠重构卵细胞骨架恢复情况均有影响，且差异有统计学意义。结论 本研究选取的 浓度范围内，中剂量组优于常规组。关键词纺锤体；移植；胚胎发育 ：中图分类号 文献标志码 文章编号 （），（.，；.，；.，）（），（），第 卷第期 年月河北医科大学学报 ，（）（），（）（），（），（）（），（），（），；线粒体是真核细胞中必不可少的细胞器，主要通 过 氧 化 磷 酸 化（，）产生细胞能量。线粒体疾病是指线粒体基因组和（或）核基因组突变，导致细胞 障碍引起的一类疾病，目前尚无方法治愈。在大多数病 例中，临 床表现往往 各 不相 同，疾病 谱 重叠。儿童每 万人中 人患病，成年人每 万人中 人患病，在所有致病性突变中每 万人中 人 患 病。目 前 预 防 重 线 粒 体（）疾病遗传的常规方法包括产前诊断和胚胎植 入 前 遗 传 学 诊 断（，）。产前诊断是一种对不同妊娠早期阶 段 的 细 胞 进 行 采 样 的 技 术，可 用 于 降 低 严 疾病地风险，并可在突变负荷高时选择终止。产前诊断的主要困难是 突变负载在不同组织之间可能不同，也可能取决于取样时的胎儿发育阶段。技术开发于 年前，最近几年才应用于减少或消除 疾病。该技术是从早期胚胎中取出的一个或多个细胞进行基因检测，并选择无突变或低突变负荷的胚胎移植到子宫。但 并 不 适 合 所 有 携 带 致 病 性 突变的患者，包括具有同源 突变或仅产生高突变负荷的患者。然而，女性患者必须生产出突变水平低于疾病表达临界阈值的胚胎，才有可能生育一个健康的婴儿。这就有了对替代技术的需要，以减少 疾病的遗传风险，如核质置换技术。核质置换技术是从携带 突变的卵母细胞或受精卵中取出细胞核，然后转移到的去核供体卵母细胞或受精卵中。该技术包括生发泡移植 、极体移植 、纺锤体移植 、原核移植 等。其中纺锤体移植是迄今为止研究最充分的核质置换技术。有大量数据显示该技术安全性最强，最具临床转化及临床推广潜力。本研究小鼠纺锤 体 移 植，采 用 不 同 浓 度 的 细 胞 松 弛 素（，）处理，通过检测重构卵母细胞骨架和统计重构胚胎发育情况，筛选出更优 浓度，为人类纺锤体移植技术提供可靠的实验数据。材 料 与 方 法实验动物及主要试剂小鼠品系为 清洁级小鼠，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司。雌鼠周龄为周，雄鼠月龄为个月。（，德国）、仙台病毒（，）（，日本）、（宁波三生，中国）、绒毛膜促性腺激素（，）（宁波三生，中国）、多聚甲醛（，德国）、小鼠抗微管蛋白抗体（，德国）、（，德国）、山羊抗鼠抗体（，德国）、标记的鬼笔环肽（，中国）、聚乙烯醇封片剂（，德国）实验方法卵子准备雌性 小鼠腹腔注射 ，后注射 诱导超排，注射 后取卵，挑选形态正常的期卵母细胞（形态饱满，光亮），用体外操作液洗次。再转河 北 医 科 大 学 学 报第 卷第期移到过夜平衡的受精液中，置于培养箱中待用。纺锤体移植（，）及分组 是指从 期卵母细胞中取出纺锤体染色体复合物，并将其转移到另一个已去核的 期卵母细胞中的过程。将准备好的卵子放在含有不同浓度 操作液中孵育，时间均为 。用持卵针固定住卵，在偏振光镜下将纺锤体摆放成梭形，置于 点钟位置，再用激光打透纺锤体对应部分的透明带，去核针经透明带缺口轻轻地吸出纺锤体染色体复合物，注意尽量少带纺锤体周围的胞浆。然后把取出的细胞核转移到 中浸泡 左右，再将带有 的细胞核注入另外已经去核的卵母细胞的卵周间隙中，最后将其转入受精液中继续孵育，观察融合情况。分组：浓度 为常规组、浓度 为低剂量组、浓度 为中剂量组、浓度 高剂量组。精子获能成年健康的公鼠断颈处死，迅速分离出附睾尾和输精管，剪下附睾尾（尽可能去除脂肪），在体式镜下用精细剪将附睾尾剪 下，用镊子轻轻挤出精子，然后将其转移到过夜平衡的精子获能液中，再置于 培养箱中获能，获能后行体外受精（，）。获能好的精液呈云雾状，杂质少。各组重构卵，洗涤后分别置于过夜平衡的 受精液中（每滴放小于或等于 枚），然后将已获能的精液加入到有卵母细胞的受精液滴中，放入 培养箱，后观察受精情况，并转移到卵裂液中继续培养。囊胚细胞计数各组挑选出 枚左右扩张期囊胚，分别用多聚甲醛固定，室温 ；液清洗次，次；将囊胚放入配制好的 中染核，室温避光孵育 ；液再清洗次，次；将处理好的囊胚转移到载玻片上，用 聚乙烯醇防荧光淬灭封片剂封片；在荧光显微镜下观察，用紫外光激发蓝色荧光，统计囊胚细胞总数。微管 蛋白和微丝的免疫荧光染色本实验对各组重构卵母细胞融合后、进行取样固定。简单介绍染色过程如下：各组重构卵母细胞通过连续激光打孔方式去除透明带，清洗，用 多聚甲醛中固定半小时，转移到 中，清洗，转移到含有 的封闭液中。处理好的卵放入 封闭液稀释的小鼠抗微管蛋白抗体中，冰箱过夜；然后转入 封闭液稀释的二抗（山羊抗鼠抗体）中，室温避光；再转移到 封闭液稀释的 标记鬼笔环肽液中，室温避光；最后转移到 清洗液稀释的 中，室温避光 。根据盖玻片的大小，把凡士林石蜡混合物，滴在干净的盖玻片上做个小柱，在个小柱中间滴上 液，将处理好的卵转到 液中，小心盖压，使样品位置固定，用 聚乙烯醇防荧光淬灭封片剂封片。低温保存，尽快用共聚焦显微镜观察，拍照。免疫荧光分析分析方法采用 深度学习原理，基于海量数据进行算法训练并集成为自动化图像分析软件。具体过程如下，循迹：自动定位并沿待测组织圈定待测区域，可根据具体要求手动定位；选色：根据 自动进行阳性判断，可根据具体情况手动修正；运算：根据需求，软件自动定位细胞核并扩展胞质范围；计算阳性细胞数量以及面积；累积光密度（，）；组织面积等不同参数；分析：高倍下逐步计算待测区域。完成后根据原始基础数据以及算法公式自动对各个项目进行计算得出分析结果。评价项目阳性强度，个阳性点颜色深浅的平均值：反应整个片子或者某个区域阳性的平均深浅度。明场为平均光密度，暗场为平均强度，数值越大阳性程度越强。平均光密度值累积光密度值阳性像素面积。统计学方法应用 统计软件分析数据。计量资料采用单因素方差分析和 检验，计数资料采用 检验。为差异有统计学意义。结果比较各组移植效率低剂量组、中剂量组、高剂量组与常规组相比，注核率、融合率差异无统计学意义，即小鼠纺锤体移植效率差异无统计学意义（），见表。表各组移植效率比较 （株数，）组别去核注核融合常规组 （）（）低剂量组 （）（）中剂量组 （）（）高剂量组 （）（）值 值 河 北 医 科 大 学 学 报第 卷第期比较各组胚胎发育情况高剂量组的受精率低于常规组（）；高剂量组的囊胚率、孵化率低于常规组（）。见表。表各组胚胎发育情况比较 （株数，）组别融合受精（）卵裂（）囊胚（）孵化（）常规组 （）（）（）（）低剂量组 （）（）（）（）中剂量组 （）（）（）（）高剂量组 （）（）（）（）值 值 值 与常规组比较值 与中剂量组比较（检验）比较不同浓度 重构小鼠囊胚细胞总数为了避免胚胎级别对实验结果的影响，所有实验均选择扩张期囊胚进行实验。高剂量组的囊胚细胞总数少于常规组（），中剂量组的囊胚细胞总数多于常规组（）。见表，图。免疫荧光染色比较重构小鼠卵母细胞骨架恢复情况融合后观察，微丝出现在纺锤体周围；融合后观察，逐渐出现在皮质区域；融合后观察，各组基本恢复正常。低剂量组、中剂量组、高剂量组和常规组相比，不同时间重构小鼠卵微丝阳性比率差异无统计学意义（）；但不同时间各组微丝的平均光密度值，组间比较差异有统计学意义（），时间点间比较有差异（），组间 的 时 间 变 化 趋 势 差 异 有 统 计 学 意 义（），即不同浓度 和不同观察时间对小鼠重构卵细胞骨架恢复情况均有影响，且差异有统计学意义。见表，和图。表各组囊胚细胞总数比较 （，）组别囊胚细胞总数常规组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 值 值 值 与常规组比较（检验）图各组囊胚免疫荧光染色 常规组；低剂量组；中剂量组；高剂量组 河 北 医 科 大 学 学 报第 卷第期图各组融合后细胞骨架恢复情况 表不同时间各组微丝的阳性比率比较 （个数，）组别染色（枚）（）（）（）常规组 （）（）（）低剂量组 （）（）（）中剂量组 （）（）（）高剂量组 （）（）（）值 值 表不同时间各组微丝的平均光密度值比较 （，）组别常规组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 组间值 值 时点间值 值 组间时点间值 值 河 北 医 科 大 学 学 报第 卷第期图各组融合后细胞骨架恢复情况 河 北 医 科 大 学 学 报第 卷第期图各组融合后细胞骨架恢复情况 讨论线粒体病是因遗传缺陷引起线粒体代谢酶的缺陷导致 合成障碍，能量产生不足而出现的一组系统疾病，目前临床不能治愈。核质置换技术的优势是可以有效预防突变 向子代传递，已在人类和动物模型上得到了证实。虽然临床上已有通过核质置换技术出生的婴儿，但是实验过程中重构囊胚效率及质量较低，且可用于移植的囊胚极少。因此，现阶段提升核质置换技术效率和重构囊胚的质量，已本领域研究的重点、难点和热点。年 和 开发了小鼠原核移植，并获得子代，由此奠定了核质置换技术的基础。即从一个受精卵中取出原核，注入到另一个去核的胞质中，细胞骨架抑制剂（和秋水酰胺）的前提下，使得原核很容易被取出，从而提高了受精卵的存活率。的重组受精卵发育到桑椹胚或囊胚阶段，移植到假孕雌鼠后产生活的后代（活出生率：）。该研究中 浓度为，原核移植效率为 左右。年，等 发表了第一篇人类卵纺锤体移植的文章，该研究进一步证实核质置换技术的可 行 性，同 时 报 道 卵 胞 质 内 单 精 子 注 射（，）后，出现相当比例的受精异常。与正常组比较，人类重构卵的异常受精率更高（分别为、），但在非人类灵长类纺锤体移植后受精卵中未观察到，这可能是由于摘除和转移过程中卵母细胞过早激活或纺锤体损伤所致。在本研究中未观察到小鼠重构卵异常受精，考虑可能与细胞融合方式或受精方式有关。该研究人纺锤体移植使用的 浓度为，重构卵正 常 受 精 的 囊 胚 率 是，对 照 组 囊 胚 率 是；而且重构胚胎中核相关的 含量很低。年，张进教授等报道了世界第一例人纺锤体移植活体婴儿出生。由张进教授等在墨西哥操作完成，并顺利活产一名健康男婴。患者为一名 岁的女性，经历了四次流产，活产两名儿童，但由于母亲遗传的 突变（）水平过高而死亡，已知这种突变可导致 综合征（）。该研究人纺锤体移植，使用的 浓度为，重构卵中受精枚，有枚发育至囊胚。选择胚胎移植的重构囊胚中，突变负荷的平均水平为，而出生后采集的多个组织中 突变负荷的平均水平