不同陆地棉品种愈伤组织诱导比较及遗传转化验证_鲍红帅.pdf

第 46 卷第 1 期2023 年 1 月河 北 农 业 大 学 学 报JOURNAL OF HEBEI AGRICULTURAL UNIVERSITYVol.46 No.1Jan.2 0 2 3不同陆地棉品种愈伤组织诱导比较及遗传转化验证鲍红帅，尚红燕，王国宁，王省芬，马峙英，吴金华（河北农业大学 农学院/华北作物改良与调控国家重点实验室/河北省作物种质资源重点实验室，河北 保定 071000）摘要：愈伤组织的诱导能力受基因型的影响，基因型的拓宽可促进棉花遗传转化的发展。本文以 8 个陆地棉品种的下胚轴为材料，研究不同品种愈伤组织的增殖和状态差异，然后以可再生的品种为受体进行 GhAPX 基因的遗传转化。结果表明：8 个品种均能诱导出愈伤组织，且 2 号和 3 号陆地棉品种愈伤组织增殖速度快，依次为 7号、1 号和 8 号，除 5 号和 6 号外，其它品种均获得再生植株；获得以 8 号品种为受体转 GhAPX 基因且经 PCR鉴定的阳性苗 3 株，Real-time PCR 分析显示 GhAPX 基因在 3 株阳性植株中都上调表达。本研究为棉花遗传转化中受体基因型的拓宽奠定了基础。关 键 词：陆地棉；下胚轴；愈伤组织；基因型中图分类号：S188 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：文献标志码：AComparison of callus induction ability of different upland cotton varieties and verification of genetic transformation BAOHongshuai,SHANGHongyan,WANGGuoning,WANGXingfen,MAZhiying,WUJinhua(College of Agronomy/State Key Laboratory of North China Crop Improvement and Regulation/Key Laboratory for Crop Germplasm Resources of Hebei,Hebei Agricultural University,Baoding 071000,China)Abstract:The induction ability of callus is affected by genotype.And broadening of genotype is important for the development of cotton genetic transformation.The hypocotyls collected from eight upland cotton varieties were used as materials to study the callus proliferation and callus status.Then GhAPX gene was transformed into the regenerated variety.The results showed that callus could be induced from the hypocotyls of all the eight varieties,and the callus of variety No.2 and No.3 proliferated rapidly,followed by variety No.7,No.1 and No.8.Regenerated plants were obtained except variety No.5 and No.6.Finally,we obtained three positive plants of variety No.8 which were identified by PCR of the transformed GhAPX gene.Real-time PCR analysis further confirmed higher transcripts of GhAPX gene in all the three positive plants.This study laid a foundation for broadening receptor genotypes in cotton genetic transformation.Keywords:upland cotton;hypocotyl;callus;genotype收稿日期：2022-05-26基金项目：国家自然科学基金项目（31401426）.第一作者：鲍红帅（1999），男，河北邢台人，硕士研究生，主要从事棉花遗传育种.通信作者：吴金华（1978），女，山西朔州人，博士，副研究员，主要从事棉花遗传育种.E-mail:本刊网址：http:/文章编号：1000-1573(2023)01-0031-06DOI：10.13320/ki.jauh.2023.0005棉花是仅次于粮食的第二大农作物，也是重要的经济作物，涉及农业和纺织工业两大产业，是关系国计民生的战略物资。我国的棉花一直处于供不应求的局面，因此利用基因工程技术培育高产、优质、32第 46 卷河 北 农 业 大 学 学 报抗病虫等的棉花品种已得到国家的高度重视与大力支持。棉花组织培养再生技术是基因工程的手段，包括体细胞胚胎发生和器官发生，体细胞胚胎发生再生体系的建立是棉花高效的遗传转化技术的基础1-3。大量研究表明体细胞胚胎发生再生的棉花转基因体系具有遗传稳定性好和嵌合体少等优点，是棉花遗传转化的首选途径4。随着棉花基因工程和转基因育种的不断发展，陆地棉的组织培养和遗传转化技术已经被建立和完善5。刘丽等6通过诱导研究，建立了新陆早 32 号和新陆早 33 号的再生组织培养体系；邹甜等7以具有一定胚胎发生能力的陆地棉品种珂字棉 312的下胚轴为外植体，成功的建立了体细胞胚胎发生及植株再生体系；葛书娅等8建立了新陆早 45 号的再生组织培养体系。Li 等9利用连续再生驯化策略培育出具有高再生能力的棉花品种Jin668。这些研究极大地推动了全球棉花体细胞培养技术的发展和再生植株的研究。但棉花组织培养中存在的体细胞培养和再生困难、基因型依赖性强、遗传转化率低等问题还未能解决，仍然制约着生物技术在棉花育种和生产中的应用。棉花胚胎发生的再生途径只有在有限的陆地棉材料上获得了成功，所以现在迫切需要扩展不同基因型棉花再生体系。体细胞胚胎发生是从愈伤组织的诱导到愈伤组织的再分化。愈伤组织的诱导受细胞内外多种因素的影响，愈伤组织的不同状态,包括颜色、质地等,都决定是否能分化出体细胞胚和再生植株。诱导愈伤组织是棉花组织培养的初始阶段，能否诱导出活力旺盛而易分化的愈伤组织是建立棉花组织培养再生体系的前提。抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate peroxidase；APX）是一种血红素过氧化物酶，是植物体内抗坏血酸谷胱甘肽循环（AsA-GSH）中关键的酶之一10，以抗坏血酸作为电子供体清除植物体内的过多的过氧化氢（H2O2），反应为过氧化氢（H2O2）+2 抗坏血酸（Ascorbate）2 水（H2O）+2 单脱氢抗坏血酸（Monodehydroascorbate）11。前人研究的珂字棉系品种再生能力强，但是综合农艺性状较差。本试验采用课题组育成农艺性状较好的品种为研究对象，同时以珂字棉系部分品种和 YZ-1 为对照材料，比较其在愈伤诱导过程中的差异，为后续基因遗传转化中受体基因型的选择奠定基础，同时将可再生品种作为受体进行 GhAPX 基因的遗传转化，以验证筛选到的受体品种的遗传转化能力。1 材料与方法1.1 试验材料供试材料为 8 个陆地棉品种（1-YZ-1；2-珂201；3-珂 312；4-农大棉 7 号；5-农大棉 8 号；6-农大 601；7-冀棉 19；8-冀棉 14），供试基因GhAPX 的质粒，均由河北农业大学农学院棉花育种组保存并提供。农杆菌菌株为 LBA4404 购自大连宝生物公司，常规试剂为国产分析纯。引物合成以及 DNA 测序委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。1.2 试验方法1.2.1供试培养基配制根据试验需要配制种苗培养基和愈伤组织诱导培养基（表 1）。基本培养基为 MS 培养基（含有机），配制好的培养基于 121 高温高压蒸汽灭菌 15 min 后分装备用。表 1 供试培养基配方Table 1 Media used for callus induction培养基Media培养基成分Component of mediapH 值pH value种苗培养基1/2 MS+葡萄糖 15 g/L5.8 6.0愈伤诱导培养基MS+IBA 1 mg/L+KT 0.5 mg/L+葡萄糖 30 g/L5.8 5.851.2.2 种子的处理 每个品种选取 100 粒成熟度好且大小均匀饱满的棉籽去壳，无菌条件下将种仁先用 75%乙醇表面浸泡 1 min，然后用 0.1%HgCl2 浸泡 8 10 min，最后用无菌水冲洗 3 5 次。无菌水中浸泡暗培养过夜至种子露白，温度为（282）。1.2.3 无菌苗的获得 露白后的种子种到种苗培养基上，每瓶培养基种苗 8 棵，每个品种种 10 瓶，放到 28 暗培养箱中培养 2 3 d。1.2.4 愈伤组织的诱导 待幼苗长到 3 cm 以上，两片子叶完全展开时，无菌条件下切去靠近子叶呈绿色及靠近根呈白色的部位，保留无菌幼苗下胚轴中间段，切成 0.8 1 cm 的小段，注意切口要平滑，不要损伤下胚轴。每个品种保证 50 个以上切段，于温度（282），光照强度 2 000 Lx，16 h 光照/8 h 黑暗的光照培养室中。1.2.5 愈伤组织的继代与增重 下胚轴培养 2 个月33第 1 期鲍红帅，等：不同陆地棉品种愈伤组织诱导比较及遗传转化验证后形成愈伤组织，愈伤组织诱导培养每隔 15 d 继代一次，将无褐变的愈伤组织转移到新鲜的愈伤组织诱导培养基中进行增殖培养，愈伤组织共继代 3 次，每次继代时先称培养基的重量，将愈伤组织转接进去后按以上方法再称重，计算出单个愈伤组织的重量。继代后观察愈伤组织形态。采用Excel 2007和进行数据方差分析及多重比较。1.2.6转 GhAPX 基因的阳性苗鉴定 以可再生的品种为受体转化 GhAPX 基因进行超表达，获得的再生植株长到接近三角瓶瓶口约 8 10 cm 时进行阳性鉴定。采用 CTAB 法提取幼嫩叶片的基因组 DNA，根据基因及载体序列设计跨载体检测引物，对提取的基因组 DNA 进行 PCR 扩增，并对扩增产物进行测序检测。跨载体引物序列为 F1（5-GACGTAAGGGATGACGCACA-3）和 R1（5-AGGTGGTGGGTGAGGCTTGT-3）。1.2.7 GhAPX 基因在转基因植株中表达分析 阳性植株 RNA 提取和反转录分别通过天根生化科技(北京)有限公司 RNAprep Pure 多糖多酚植物总 RNA 提取试剂盒与反转录试剂盒 TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(TIANGEN Biotech)，具体操作按照说明书进行。qPCR 表达分 析 所 用 PerfectStart Green qPCRSuperMix 购 自北京全式金生物技术有限公司。qPCR 引物为 qF(5-AGTGTGCTTGTGCTCAACTCGT-3)和 qR（5-ATGGACCTCCGGTCTTGGTCTT-3）;棉花GhHis3 作为内参，GhHis3-qF（5-TCAAGACTGATT TGCGTTTCCA-3）和 GhHis3-qR（5-GCGCAAAGG TTGGTGTCTTC-3）。反应体系和反应条件参照杨君等12的方法，在 Bio-Rad CFX96 Real-time System 荧光定量