白藜芦醇抑制TLR4_NF...毛细支气管炎小鼠的保护作用_高凯霞.pdf

论著基金项目:山东省自然科学基金(ZR2014HL001);山东省滨州市软科学研究计划项目(2016BRK19);山东省医药卫生科技发展计划项目(2013WS0312)通信作者:吴福玲,E-mail:白藜芦醇抑制 TLR4/NF-B 通路对毛细支气管炎小鼠的保护作用高凯霞 吴福玲 石 涛 高 萌 张雪静 秦英飞 邝哲姝滨州医学院附属医院儿科(滨州 256600)【摘 要】目的研究白藜芦醇通过抑制 T 样受体 4/核因子-B(TLR4/NF-B)通路对呼吸道合胞病毒(RSV)毛细支气管炎小鼠的保护作用。方法 选取 30 只小鼠随机分为对照组、RSV 组、给药组,建立 RSV 毛细支气管炎小鼠模型,检测小鼠肺组织中 TLR4、NF-B 的变化;利用肺组织 HE 染色、ELISA 法检测白藜芦醇给药前后气道炎症病变、IL-6、TNF-因子水平,Western Blot 法及实时定量 PCR 法检测 TLR4、NF-B 蛋白及基因表达等相关变化。结果 与对照组相比,RSV 组小鼠组肺组织中 TLR4、NF-B 水平升高,肺组织切片 HE 染色显示气道炎症细胞浸润加剧,ELISA 检测炎性因子 IL-6、TNF-升高;而给药组处理后,肺组织 TLR4、NF-B 的表达下调,病理改变减轻,炎性因子 IL-6、TNF-下降。结论白藜芦醇可通过抑制 TLR4/NF-B 通路抑制炎性因子的释放,从而减轻毛细支气管炎小鼠的气道炎症反应。【关键词】毛细支气管炎;白藜芦醇;TLR4;NF-B;呼吸道合胞病毒 DOI:10.3969/j.issn.1000-8535.2023.02.003Protective effect of resveratrol on bronchiolitis mice by inhibiting TLR4/NF-B pathwayGAO Kaixia,WU Fuling,SHI Tao,GAO Meng,ZHANG Xuejing,QIN Yingfei,KUANG ZheshuDepartment of Pediatrics,Affiliated Hospital of Binzhou Medical College,Binzhou 256600,China【Abstract】ObjectiveTo study the protective effect of resveratrol on lung tissue of respiratory syncytial virus(RSV)bronchiolitis mice by regulating TLR4/NF-B pathway.MethodsThirty mice were randomly divided into controlgroup,RSV group and resveratrol group.The mice models of RSV bronchiolitis were established,and the changes of TLR4and NF-B levels in lung tissues of mice were detected.HE staining and ELISA were used to detect airway inflammation,IL-6 and TNF-levels before and after resveratrol administration.TLR4 and NF-B protein and gene expressions were detectedby Western Blot and real-time quantitative PCR.Results Compared with the control group,the levels of TLR4 and NF-Bin the lung tissues of mice with bronchiolitis were significantly increased.Airway inflammatory cell infiltration was aggravatedin HE staining of lung tissue sections,and inflammatory factors IL-6 and TNF-were significantly increased showing byELISA.The expressions of TLR4 and NF-B in resveratrol group were down-regulated after treatment.ConclusionsRes-veratrol can inhibit the release of inflammatory factors by inhibiting the TLR4/NF-B pathway,play a protective role in micewith bronchiolitis.【Key words】bronchiolitis;resveratrol;TLR4;NF-B;respiratory syncytial virus 毛细支气管炎多由呼吸道合胞病毒(respirato-ry syncytial virus,RSV)感染引起,常见于 2 6月婴幼儿,临床特点主要表现为喘息、三凹征、气促1。目前的治疗方案以抗感染、控制喘息等对症支持治疗为主,尚无特异性治疗方法。RSV毛细支气管炎涉及到由多种细胞和细胞因子参与的固有免疫应答和适应性免疫应答2。其中 Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs),特别是 TLR3、TLR4、TLR7 等受体及其衔接蛋白与 RSV 感染关系密切3。而 NF-B 是一种核转录因子,具有多种生物学活性,NF-B 途径可调节与喘息相关的呼吸道炎症基因,抑制 NF-B 活性可减轻气道炎症反应,从而改善气道重塑4。已有相关研究表明,机体感染 RSV 后可激活 TLR3 通路,进而激活 NF-B,通过信号传导,引起下游炎性细胞因子的过度表达,加重气道炎症反应5。白藜芦醇(res-81广州医药 2023 年 2 月第 54 卷第 2 期veratrol,Res)是一种非黄酮类多酚有机化合物,广泛存在于葡萄、虎杖等 70 多种植物中,口服容易吸收,可随尿液、粪便代谢排出,其具有抗炎、抗过敏、抗氧化、抗肿瘤等多种生物学作用6。近年来,白藜芦醇的有益作用已在哮喘、肺纤维化、肺动脉高压和其他肺部疾病中被证明7-8。而TLR4 与毛细支气管炎相关的具体机制仍不完全清楚。本文通过建立毛细支气管炎小鼠模型并予白藜芦醇干预,来探讨白藜芦醇对毛细支气管炎小鼠肺组织 TLR4/NF-B 通路的调控作用。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 试剂 白藜芦醇、BCA 蛋白浓度测定试剂盒购 自 Solarbio;兔 抗 鼠 多 克 隆 抗 体 GAPDH、TLR4 及 NF-B 购自武汉三鹰公司;胎牛血清购自四季青公司;小鼠白介素-6(interleukin,IL-6)、肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor-,TNF-)试剂盒为上海朗顿公司产品。1.1.2 制备 RSV 病毒RSV A2 株由山东省病毒研究所馈,将液氮冻存人宫颈癌(Hela)细胞复苏后,用含 10%培养液常规传代培养。将病毒悬液接种于 Hela 细胞,在 37、2%FBS 培养基中培养,至 80%细胞发生病变时反复冻融,1 000 r、5 min 收集 RSV 病毒悬液,空斑实验检测病毒滴度。1.1.3 实验动物选取 30 只 6 8 周龄 18 22 gB/C 雄性小鼠,购自朋悦实验动物繁育有限公司,许可证号:SCXK(鲁)2019-0003,由滨州医学院附属医院动物房分笼饲养适应 1 周。1.2 方法1.2.1 分组造模将 30 只小鼠随机分为对照组、RSV 组及给药组(白藜芦醇 25 mg/kg)9,每组小鼠 10 只。RSV 组和给药组均予 RSV 病毒悬液滴鼻100 L/天,连续2 天10,对照组予100 L 磷酸盐缓冲液(PBS)滴鼻 2 天对照;给药组滴鼻 2 小时后予白藜芦醇 25 mg/kg、0.2 mL 腹腔注射,连续 3天。对照组和RSV 组滴鼻2 小时后予0.2 mL PBS 腹腔注射,连续3 天。造模过程中无小鼠死亡。1.2.2 收集肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage flu-id,BALF)造模结束后第 2 天进行取材,5%水合氯醛(剂量 0.1 mL/10 g)麻醉小鼠,充分暴露气管,用 1 mL 灌洗液灌洗气管,重复抽吸 3 次,确保回收量大于 0.8 mL,低温高速离心取上清液,-20 冰箱保存。1.2.3肺组织病理观察采取颈部脱臼法处死小鼠,剥离小鼠肺组织,取右肺中叶用 10%多聚甲醛灌注固定 48 小时,用升序蔗糖脱水,包埋剂包埋,冰冻切片机切片,厚度约 5 m,切片后固定,固定时间为30 s 1 min,清水稍冲洗1 2 s。苏木素染色,时间大概为3 5 min;然后清水洗去苏木素,大概 5 10 s。促蓝液返蓝 5 10 s;清水稍冲洗 1 2 s。伊红染色 10 20 s,然后脱水、透明、中性树胶封固。400 倍光镜下观察。1.2.4ELISA 法测定 BALF 中 IL-6、TNF-的水平按照试剂盒说明书步骤检测 BALF 中 IL-6、TNF-的含量,根据标准品做出标准曲线,计算各组炎性因子水平变化。1.2.5 Western blot 检测各组小鼠肺组织中 TLR4、NF-B 蛋白水平 用匀浆器提取肺组织蛋白,BCA法测蛋白浓度,根据蛋白分子量大小值配胶,上样量为 50 g 进行电泳,将蛋白转膜,用 5%脱脂奶粉封闭 2 小时,一抗(兔抗鼠多克隆抗体 TLR41:1 000、兔抗鼠多克隆抗体 NF-B 1:1 000、兔抗鼠多克隆抗体 GAPDH 1:5 000)4 冰箱孵育过夜,TBST 洗膜 3 次,10 分钟/次,摇床孵育二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 1:5 000)2 小时,TBST 洗膜 3 次,10 分钟/次,于暗室曝光。分析软件分析条带吸光度值(A 值)。结果用A TLR4/A GAPDH、A NF-B/A GAPDH 表示。1.2.6逆转录-定量 PCR(RT-qPCR)检测 TLR4mRNA、NF-B mRNA 表达将肺组织(100 mg)加入 1mL Trizol 研磨匀浆,提取总 RNA。总 RNA根据 PrimeScript RT 试剂盒的说明进行逆转录。使用 SYBR-Green Master Mix(Takara Bio,Inc.)进行 qPCR。根据制造商的方案;在推荐的参数下进行扩增:在94 的初始变性3 min,扩增40 个循环,94 20 s,55 15 s 和 72 25 s,最后在94 延伸 20 s。用 2-CT法计算目的基因的表达水平。基因名称 序列大小引物序列(53)TLR4310F:GGTGAGAAATGAGCTGGTAR:TCTGCTAAGAAGGCGATANF-B425F:GCGCATCCAGACCAACAATAACR:GCCGAAGCTGTGGACACTGAPDH526F:CCACTTGAAGGGTGGAGCR:TGAAGTCGCAGGAGACAA91http:/1.3 统计分析数据用 SPSS 26.0 统计软件进行分析。定量数据以 x s 表示,采用 t 检验比较 2 组间的差异。P0.05 被认为有统计学意义。2 结 果2.1 小鼠 BALF 中 IL-6、TNF-的水平RSV 组炎性因子水平升高,给药组可降低毛细支气管炎小鼠 BALF 中炎症因子水平。ELISA 结果显示,对照组小鼠 BALF 中 IL-6 的表达量为(12.26 6.25)pg/mL;RSV