胡萝卜4CL基因家族的鉴定及分析.pdf

西 北 农 业 学 报 2 0 2 3,3 2(9):1 3 6 5-1 3 7 5A c t a A g r i c u l t u r a e B o r e a l i-o c c i d e n t a l i s S i n i c ad o i:1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 4-1 3 8 9.2 0 2 3.0 9.0 0 5h t t p s:/d o i.o r g/1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 4-1 3 8 9.2 0 2 3.0 9.0 0 5 胡萝卜 4 C L基因家族的鉴定及分析收稿日期:2 0 2 2-0 2-2 1 修回日期:2 0 2 2-0 3-2 5基金项目:河北省自然科学基金(C 2 0 2 0 4 0 8 0 0 6);国家重点研发计划(2 0 1 9 Y F D 1 0 0 0 3 0 5-0 9);河北省高等学校科学技术研究项目(B J 2 0 1 8 0 4 4)。第一作者:张新业,男,博士,讲师,主要从事植物分子育种研究。E-m a i l:z h i g a n c a o 1 2 6.c o m通信作者:周志国,男,博士,副教授,主要从事蔬菜作物分子育种研究。E-m a i l:z h i g u o_z h o u 1 6 3.c o m张新业1,2,3,李文静1,2,3,闫训友1,郑 京1,朱 姝1,王聪艳1,周志国1(1.廊坊师范学院 生命科学学院,河北廊坊 0 6 5 0 0 0;2.河北省动物多样性重点实验室,河北廊坊 0 6 5 0 0 0;3.廊坊市细胞工程与应用研究重点实验室,河北廊坊 0 6 5 0 0 0)摘 要 旨在全基因组水平上鉴定胡萝卜 4 C L基因,揭示该基因家族成员的理化性质、系统进化、基因结构、组织表达模式 及 胁 迫 响 应 情 况,为 胡 萝 卜 4 C L的 功 能 研 究 和 利 用 奠 定 基 础。基 于AMP结 合 结 构 域(P F 0 0 5 0 1)的隐马尔可夫模型文件,利用HMME R软件对胡萝卜蛋白质数据库进行检索,获得胡萝卜 4 C L基因(命名为 D c 4 C L);利用P r o t P a r a m分析 D c 4 C L的理化性质;利用ME G A 6对D c 4 C L进行系统进化分析;使用G S D S 2.0、MEME分析 D c 4 C L的基因及蛋白结构;利用荧光定量P C R技术对 D c 4 C L的组织表达模式及胁迫响应情况进行研究。结果表明,胡萝卜基因组中存在1 2个 4 C L基因,分别为 D c 4 C L 1 D c 4 C L 1 2。D c 4 C L基因开放阅读框(OR F)长度为1 3 5 03 3 6 3 b p,编码蛋白质长度为4 4 91 1 2 0 a a,编码蛋白的分子质量和等电点分别为4 8.9 21 2 3.7 3 k u和5.3 48.8 2。系统进化分析表明,D c 4 C L与其他来自水稻、拟南芥、二穗短柄草、高粱、大白菜的4 C L蛋白可分为两个类群。结构分析表明,D c 4 C L基因外显子数目为41 1个,其蛋白序列中均含有B o x(S S G T T G L P KG V)和B o x(G E I C I R G)两个保守序列。荧光定量P C R结果表明,D c 4 C L 3、D c 4 C L 1 2在胡萝卜叶片及肉质根中均有表达,而 D c 4 C L 8主要在叶片中表达,盐胁迫和低温胁迫均使 D c 4 C L 3、D c 4 C L 8、D c 4 C L 1 2的表达降低。总之,胡萝卜的1 2个 D c 4 C L基因在影响4 C L蛋白功能的关键位点处具有保守性,而在其他位置上存在一定的差异,且部分成员在逆境胁迫应答过程中可能发挥了一定的作用。关键词 胡萝卜(D a u c u s c a r o t a);4-香豆酰C o A连接酶(4 C L);基因家族;生物信息学分析;基因表达分析 木质素是构成植物细胞壁的重要大分子,能够起到机械支撑、保证水分运输的作用,并能协助植物抵御病虫害1。木质素作为非糖类膳食纤维,广泛分布于谷物、水果和蔬菜中,具有多种生理调节功能2。但木质素含量过高会导致肉质根类蔬 菜“糠 心”,并 严 重 影 响 其 食 用 和 营 养 价值3-4。因此,木质素含量已成为肉根类蔬菜重要改良方向。苯丙烷代谢是植物木质素单体及类黄酮合成的共 同 途 径。4-香 豆 酰C o A连 接 酶(4-c o u-m a r o y l-C o A l i g a s e,4 C L)位于苯丙烷代谢末端,能够催化对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸生成相应的辅酶A酯,是木质素和类黄酮合成的关键酶之一5。4 C L氨基酸序列中存在2个保守的多肽序列-B o x(S S G T T G L P K GV)和B o x(G E-I C I R G),前者为AMP结合结构域,后者在催化反应过程中的作用未知6。植物中的 4 C L多以基因家族的形式存在,不同物种间 4 C L基因数目差异较大,根据参与物质合成途径的不同,可将其分为C l a s s 和C l a s s 两类,前者参与木质素单体合成,后 者 主 要 参 与 类 黄 酮 的 生 物 合 成7。4 C L基因表达水平的变化能够调节苯丙烷代谢及植物对逆境胁迫的响应。在 拟南芥(A r a b i-d o p s i s t h a l i a n a)中,成员 A t 4 C L 1对4 C L酶活的贡献较大,其功能缺失后导致木质素含量降低,而A t 4 C L 3的突变会减少类黄酮的积累8。柑橘(C i t r u s c l e m e n t i n a)4 C L 1的表达水平与类黄酮含量呈显著正相关9。棉花(G o s s y p i u m h i r s u-t u m)中 G h 4 C L 7基因沉默后,木质素含量降低2 0%,在拟南芥中过表达 G h 4 C L 7后,木质素含量提高1 0%,且 G h 4 C L 7表达量的变化与植物抗旱性 正 相 关5。禾 谷 镰 刀 菌(F u s a r i u m g r a-m i n e a r u m)侵染后会诱导小麦(T r i t i c u m a e s t i-v u m)4 C L 1 的表达,而棉花 4 C L的表达则能够响应链格孢菌(A l t e r n a r i a a l t e r n a t a)诱导1 0-1 1。杨树(P o p u l u s d e l t o i d e s P o p u l u s e u r a m e r i c a-n a)木质部导管中 4 C L的表达被抑制后,可引起木质素含量降低,但提高了其对干旱胁迫的敏感性1 2。W e n等1 3研究表明,轻度荫蔽胁迫能够诱导大豆(G l y c i n e m a x)4 C L基因的表达,并提高4 C L的酶活性。X i o n g等1 4利用V I G S技术沉默棉花 G h 4 C L 3 0基因后,引起类黄酮及木质素含量降低,而咖啡酸和阿魏酸等物质含量升高,并增强了棉花的黄萎病抗性。胡萝卜(D a u c u s c a r o t a)属伞形科2 a生植物,其营养丰富,是一种广泛种植的根用蔬菜1 5。肉质根作为胡萝卜可食用部位,木质素含量过高会降低其口感及品质1 6。胡萝卜基因组测序的完成1 7,为在全基因组水平上鉴定和挖掘木质素代谢相关基因奠定了基础。到目前为止,胡萝卜 4 C L(D c 4 C L)基因家族缺乏研究。本研究拟从胡萝卜基因组中鉴定 4 C L基因,分析其理化性质、基因结构、蛋白保守结构域和进化关系等,并利用荧光定量P C R技术对其进行组织表达特性及胁迫响应分析,以期为阐明 4 C L在胡萝卜木质素生物合成中的作用提供参考。1 材料与方法1.1 试验材料选用胡萝卜品种 黑田五寸 为试验材料。于2 0 2 1年8月7日,将 黑田五寸 种子播种于廊坊师范学院校内试验基地(河北廊坊,3 9 3 1 N,1 1 6 4 1 E),生长约1 0 0 d后,采集胡萝卜叶片及肉质根,用于分析 D c 4 C L基因的组织表达模式。将 黑田五寸 种子催芽后播种于含有培养基质(体积比为13的蛭石和营养土)的塑料花盆内,置于廊坊师范学院人工气候室,培养条件为:光照时长1 4 h/d,光照强度3 0 0 m o l/(m2s),昼/夜温度2 5/1 7 。播种后5 0 d进行低温胁迫和盐胁迫处理。将胡萝卜幼苗转移至4 培养箱中培养(其他条件同前),进行4 低温胁迫,以正常温度培养 作 为 对 照。向 花 盆 内 浇 灌6 0 0 m L 2 0 0 mm o l/L N a C l溶液,进行盐胁迫处理,以蒸馏水处理作为对照。胁迫处理1 2 h后采集胡萝卜叶片,用于检测 D c 4 C L基因胁迫处理后的表达情况。试验均设3次重复。1.2 D c 4 C L基因的鉴定研究中用到的胡萝卜基因组、C D S、蛋白质、G F F 3等数据文件均下载自E n s e m b l P l a n t s网站(h t t p:/p l a n t s.e n s e m b l.o r g/i n d e x.h t m l)。利用HMME R软 件,根 据P f a m数 据 库(h t t p:/p f a m.x f a m.o r g/)中AMP结 合 结 构 域(P F 0 0 5 0 1)的隐马尔可夫模型文件在胡萝卜蛋白数据库中进行筛选,初步获得 D c 4 C L基因。在E x c e l中剔除冗余序列,利用P f a m数据库和N C-B I数据库中的 C D-S e a r c h工具对非冗余序列进行结构域分析,最终得到 D c 4 C L基因,根据其在染色体上的排列顺序进行命名和编号。1.3 D c 4 C L的生物信息学分析利用在线工具P r o t P a r a m(h t t p s:/w e b.e x-p a s y.o r g/p r o t p a r a m/)分析基因编码蛋白的残基数(a a)、分子质量和等电点;从E n s e m b l P l a n t s网站获取 D c 4 C L基因位置及所在染色体长度,利用T B t o o l s绘 制染色体定 位图1 8;利用在线 工具C E L L O v.2.5(h t t p:/c e l l o.l i f e.n c t u.e d u.t w/)进行亚细胞定位预测1 9;利用S i g n a l P 4.1 S e r v e r(h t t p:/www.c b s.d t u.d k/s e r v i c e s/S i g n a l P-4.1/)进行信号肽预测2 0;利用TMHMM S e r v e r v.2.0(h t t p:/www.c b s.d t u.d k/s e r v i c e s/TM-HMM/)进行跨膜区预测。1.4 D c 4 C L进化关系及结构分析自E n s e m b l P l a n t s网站下载水稻(O r y z a s a-t i v a)、拟南芥、二穗短柄草(B r a c h y p o d i u m d i s-t a c h y o n)、高 粱(S o r g h u m b i c o l o r)、大 白 菜(B r a s s i c a r a p a)的4 C L蛋白序列,利用C L U S T-A LW进行多序列比对,并通过ME GA 6基于邻接法(N e i g h b o r-j o i n i n g)构建多物种系统进化树,自展值(B o o t s t r a p)设为1 0 0 0,分析D c 4 C L的系统进化关系。将D c 4 C L蛋白序列提交到MEME网站(h t-t p s:/m e m e-s u i t e.o r g/m e m e/t o o l s/m e m e),进行保守基序m o t i f分析,并在P f a m数据库中对检测到的m o t i f进行功能注释。从基因组注释G F F 3文件中提取 D c 4 C L的结构信息,利用在线软件G e n e S t r u c t u r e D i s p l a y S e r v e r(G S D S 2.0)(h t t p:/g s d s.g a o-l a b.o r g/)绘制基因结构图2 1。6631西 北 农 业 学 报3 2卷1.5 D c 4 C L家族成员的表达分析利用植物R NA提取试剂盒(天根公司,北京)分别提取胡萝卜叶片、肉质根及胁迫处理、对照材料的总R NA,电泳检测R NA质量,利用超微量分光光度计测定R NA浓度及纯度。利用G o S c r i p tTM R e v e r s e T r a n s c r i p t i o n S y s t e m(P r o-m e g a,U S A)将 各 材 料 的 总R NA反 转 录 为 c D NA,适当稀释后,-2 0 保存,备用。利用N C B I数据库在线工具P r i m e r-B L A S T设计 D c 4 C L家 族 成 员 的 定 量 引 物,以 胡 萝 卜D c A c t i n基因2 2作为内参(表1),利用荧光定量P C R技 术 分 析 D c 4 C L家 族 成 员 D c 4 C L 3、D c 4 C L 8、D c 4 C L 1 2的组织表达模式及胁迫响应情况。反应体系:2S y b r G r e e n q P C R M i x 1 0 L,c D NA 1 L,正、反向引物(1 0 m o l/L)各0.5 L,d d H2O 8 L。反应程序:9 5 2 m i n;9 5 1 5 s,6 0 2 0 s,7 2 2 5 s,循环4 0次;5 5.09 5.0 制作熔解曲线。利用2-C t法计算基因相对表达量。2 结果与分析2.1 胡萝卜 4 C L基因的鉴定及理化性质分析在胡萝卜基因组中共鉴定到1 2个 4 C L基因,均匀分布于除9号染色体外的其余8条染色体上(图1),分别命名为 D c 4 C L 1 D c 4 C L 1 2。D c 4 C L基因O R F长度介于1 3 5 03 3 6 3 b p,编码蛋白质长度介于4 4 91 1 2 0 a a,D c 4 C L蛋白分子质量和等电点分别为4 8.9 21 2 3.7 3 k u和 5.3 48.8 2。亚细胞定位预测结果表明,D c 4 C L在细胞内的分布部位多样,细胞质膜、细胞质及细胞器(线粒体、叶绿体)均有定位。信号肽及跨膜区分 析 结 果 表 明,D c 4 C L蛋 白 均 不 含 信 号 肽,D c 4 C L 3、D c 4 C L 4、D c 4 C L 5中均 存在2个 跨膜区,分 别 位 于1 0 0 a a和2 0 03 0 0 a a处,而 在D c 4 C L 2和D c 4 C L 1 0中只存在1个跨膜区,位于1 0 0 a a处,其余的 D c 4 C L成员则不含有跨膜区(表2,图2)。表1 引物信息T a b l e 1 P r i m e r s u s e d i n t h i s s t u d y引物名称P r i m e r 引物序列(5 3)P r i m e r s e q u e n c eD c 4 C L 3 FAAG C A G G T T T C A T G T G G T G C TD c 4 C L 3 RG T C A T G C C A T AA C C C T GAA T GAD c 4 C L 8 FC G G T GA G GA C G G T T A T G T C CD c 4 C L 8 RT C A T C C C A T A C C C C T GA C C AD c 4 C L 1 2 FT G T C G T A G T C C AA GA G G C A TD c 4 C L 1 2 RA C C GA G T G C T T C T T T G C GA TD c A c t i n FC G G T A T T G T G T T G GA C T C T G G T GA TD c A c t i n RC A G C AA G G T C AA GA C G GA G T A T G G 图1 D c 4 C L基因染色体定位F i g.1 C h r o m o s o m a l a s s i g n m e n t o f D c 4 C L2.2 D c 4 C L系 统 进 化、基 因 结 构 及 保 守 基 序 分析为了 研 究D c 4 C L的 系 统 进 化 关 系,利 用ME GA 6软件,以来自胡萝卜、水稻、拟南芥、二穗短柄草、高粱、大白菜的4 C L蛋白序列构建多物种系统进化树(图3)。该进 化树中含有1 2个D c 4 C L、5个O s 4 C L、3个A t 4 C L、5个B d 4 C L、5个S b 4 C L和1 5个B r 4 C L。4 5个4 C L蛋白可分为两个个类群:G r o u p、G r o u p。G r o u p包含9个D c 4 C L成员(D c 4 C L 1、D c 4 C L 2、D c 4 C L 3、76319期张新业等:胡萝卜 4 C L基因家族的鉴定及分析D c 4 C L 4、D c 4 C L 5、D c 4 C L 6、D c 4 C L 7、D c 4 C L 1 0、D c 4 C L 1 1)及8个B r 4 C L成员;G r o u p 包含3个D c 4 C L成员(D c 4 C L 8、D c 4 C L 9、D c 4 C L 1 2)及全部的O s 4 C L、A t 4 C L、B d 4 C L、S b 4 C L及7个B r 4 C L蛋白。G r o u p 中只包含胡萝卜及大白菜4 C L蛋白成员,而G r o u p中4 C L蛋白的物种来源丰富,既有单子叶植物,又有双子叶植物,但D c 4 C L成员较少。表2 胡萝卜 4 C L基因基本信息T a b l e 2 B a s i c i n f o r m a t i o n o f 4 C L g e n e f a m i l y i n c a r r o t基因名称G e n e 基因组登录号L o c u s I D转录号T r a n s c r i p t I D开放阅读框长度/b pOR F l e n g t h 氨基酸数目N u m b e r o fa m i n o a c i d s蛋白分子质量/k uM o l e c u l a r m a s s蛋白等电点I s o e l e c t r i c p o i n t亚细胞定位S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n信号肽 S i g n a l p e p t i d e D c 4 C L 1D C A R_0 0 2 9 5 3K Z N 1 0 2 9 71 6 3 85 4 55 9.1 98.6 7线粒体、叶绿体M i t o c h o n d r i a l,C h l o r o p l a s t无 N o D c 4 C L 2D C A R_0 0 6 3 9 1K Z N 0 5 5 5 41 7 0 45 6 76 1.7 66.5 3细胞质膜P l a s m a m e m b r a n e无 N o D c 4 C L 3D C A R_0 0 8 1 9 7K Z N 0 7 3 6 01 7 0 45 6 76 2.3 88.3 4叶绿体C h l o r o p l a s t无 N o D c 4 C L 4D C A R_0 0 9 5 2 3K Z N 0 0 7 6 91 6 2 65 4 15 8.3 78.3 8细胞质膜P l a s m a m e m b r a n e无 N o D c 4 C L 5D C A R_0 1 3 9 0 1K ZM 9 8 7 3 71 6 6 55 5 45 9.9 57.1 8细胞质膜、叶绿体P l a s m a m e m b r a n e,C h l o r o p l a s t无 N o D c 4 C L 6D C A R_0 1 6 4 1 1K ZM 9 3 1 6 61 3 5 04 4 94 8.9 25.9 1叶绿体C h l o r o p l a s t无 N o D c 4 C L 7D C A R_0 1 8 7 8 0K ZM 9 5 5 3 83 3 6 31 1 2 01 2 3.7 38.0 7细胞质C y t o p l a s m i c无 N o D c 4 C L 8D C A R_0 2 1 3 8 5K ZM 9 1 2 5 01 6 3 55 4 45 9.6 15.3 4细胞质C y t o p l a s m i c无 N o D c 4 C L 9D C A R_0 2 5 6 1 7K ZM 8 8 5 4 21 6 4 15 4 66 0.0 35.6 3细胞质C y t o p l a s m i c无 N o D c 4 C L 1 0D C A R_0 2 6 2 1 4K ZM 8 9 1 3 91 6 5 35 5 05 9.5 18.8 2叶绿体C h l o r o p l a s t无 N o D c 4 C L 1 1D C A R_0 2 8 2 4 8K ZM 8 4 2 0 51 5 5 45 1 75 6.2 98.6 5细胞质膜P l a s m a m e m b r a n e无 N o D c 4 C L 1 2D C A R_0 2 6 4 5 7K ZM 8 6 1 2 11 6 5 65 5 16 0.3 45.9 3细胞质C y t o p l a s m i c无 N o 为了进一步阐明D c 4 C L蛋白的保守基序及基因 结 构,分 别 利 用MEME及G S D S鉴 定D c 4 C L中的保守基序,并绘制基因结构图(图4)。结果表明,D c 4 C L蛋白中存在1 0个m o t i f,分别为m o t i f 1m o t i f 1 0。除D c 4 C L 6、D c 4 C L 1 1中含有8个m o t i f外,其余成员均含有1 0个m o t i f。M o t i f 5中包含4 C L蛋白保守序列B o x(S S G T-T G L P K GV),m o t i f 2中 包 含 保 守 序 列B o x(G E I C I R G),但不同成员在这两处的序列已发生变异。M o t i f 1和3中分别包含催化活性位点-L y s-4 3 8、G l n-4 4 3、L y s-5 2 3,其 中,L y s-4 3 8、G l n-4 4 3参与硫酯合成反应,而L y s-5 2 3参与半腺苷化反应9,2 3。其余鉴定到的m o t i f则被注释为能够参与AMP结合过程;不同的 D c 4 C L基因结构差异明显,均含有内含子,外显子数目为41 1个,其 中 D c 4 C L 2外 显 子 数 目 最 少(4个),D c 4 C L 7外显子数目最多(1 1个)。2.3 D c 4 C L家族成员的表达分析利用 荧 光 定 量P C R技 术 分 析 D c 4 C L 3、D c 4 C L 8、D c 4 C L 1 2的组织表达模式及其对盐胁迫和低温胁迫的响应情况。结果表明,D c 4 C L 3、D c 4 C L 1 2在胡萝卜叶片及肉质根中均有表达,且无显著差异,D c 4 C L 8则主要在叶片中表达(图5-A5-C);2 0 0 mm o l/L N a C l溶液处理1 2 h后,D c 4 C L 3、D c 4 C L 1 2表 达 量 下 降 不 明 显,而 D c 4 C L 8表达量显著下调,约为对照的3 1%;4 处理1 2 h后,D c 4 C L 8表达量下降不显著,而 D c 4 C L 3、D c 4 C L 1 2表达量下调,分别达到显著和极显著水平,约为对照的4 2%和2 3%(图5-D 5-F)。3 讨 论木质素为植物生长发育所必需,并参与构成膳食纤维,调理人体健康状况,但其含量增加后,会导致细胞壁增厚,组织木质化程度增高,进而影响蔬菜作物的口感,并降低食用品质2 4-2 5。木质素的生物合成过程复杂,多种酶参与其中。4 C L位于苯丙烷代谢的分支点,是将苯丙烷代谢引入木质素单体合成途径的关键酶,在植物木质素合成过程中具有重要作用2 6。8631西 北 农 业 学 报3 2卷 A.D c 4 C L 2;B.D c 4 C L 3;C.D c 4 C L 4;D.D c 4 C L 5;E.D c 4 C L 1 0;F.D c 4 C L 1;G.D c 4 C L 6;H.D c 4 C L 7;I.D c 4 C L 8;J.D c 4 C L 9;K.D c 4 C L 1 1;L.D c 4 C L 1 2图2 D c 4 C L跨膜区预测F i g.2 P r e d i c t i o n o f t r a n s m e m b r a n e h e l i c e s o f D c 4 C L96319期张新业等:胡萝卜 4 C L基因家族的鉴定及分析 O s.水稻;A t.拟南芥;B d.二穗短柄草;B r.大白菜;S b.高粱O s.O r y z a s a t i v a;A t.A r a b i d o p s i s t h a l i a n a;B d.B r a c h y p o d i u m d i s t a c h y o n;B r.B r a s s i c a r a p a;S b.S o r g h u m b i c o l o r图3 4 C L蛋白进化树分析F i g.3 P h y l o g e n e t i c t r e e o f 4 C L f r o m c a r r o t a n d o t h e r p l a n t s 4 C L基因家族已在毛果杨(P o p u l u s t r i c h o-c a r p a)2 7、水 稻2 8、拟 南 芥8、柑 橘9、水 曲 柳(F r a x i n u s m a n d s c h u r i c a)2 9、棉 花5及 毛 竹(P h y l l o s t a c h y s e d u l i s)7等物种内被鉴定,成员数目为33 4个。本研究从胡萝卜基因组中共鉴定到1 2个 D c 4 C L基因,表明不同来源的 4 C L基因数目差异较大,这可能与不同物种在进化过程中经历的染色体加倍事件有关7。蛋白亚细胞定位情况是研究其生物学功能的基础。经预测,D c 4 C L蛋白在细胞内的存在范围广泛,可分布于细胞质膜、细胞质及部分细胞器(叶绿体、线粒体)中,棉花4 C L蛋白的分布范围亦很广泛5,而柑橘4 C L蛋白、毛竹4 C L蛋白则仅分别定位于细胞质和过氧化物酶体中7,9,这可能与4 C L蛋白发挥功能的场所不同有关。在后续工作中,笔者还将通过试验手段对D c 4 C L的亚细胞定位结果进行确认。蛋白质中跨膜区的存在往往表明该蛋白为膜蛋白,且在细胞内外信号传递过程中可能发挥一定的作用。跨膜区预测结果显示,D c 4 C L 3、D c 4 C L 4、D c 4 C L 5中均存在2个跨膜区,与苎麻B n 4 C L 3中跨膜区的数目及位置均一致3 0。序列分析表明,所有的D c 4 C L蛋白均包含保守序列B o x(S S G T T G L P K GV)、B o x(G E I C I R G)及3个 保 守 的 催 化 残 基(L y s-4 3 8、G l n-4 4 3、L y s-5 2 3),并且不同的成员在B o x、B o x处的序列有所变化,这种现象在毛竹、钝鳞紫背苔(P l a g i o-c h a s m a a p p e n d i c u l a t u m)及苎麻中均有出现,但其对D c 4 C L的催化作用是否有影响还需通过试验进行分析7,3 0-3 1。前人研究通常将4 C L分为C l a s s 和C l a s s 两个类群,二者在木质素及类黄酮合成过程中发挥的作用不同且有重叠2 6,3 2。本试验利用D c 4 C L与其他物种的共4 5个4 C L蛋白构建系统进化树,所有蛋白亦被分为两个类群,类群中含有9个D c 4 C L成员,类群中含有3个D c 4 C L成员。不过,另有研究表明4 C L蛋白类群的划分可能会受到参与建树物种多寡的影响8。此外,D c 4 C L的生物学功能未知,还需通过试验进行深入研究。通过分析基因的表达模式,对研究其生物学功能具有重要意义3 3。4 C L基因的物种来源不0731西 北 农 业 学 报3 2卷同,其组织表达模式亦有所不同。本研究表明,D c 4 C L 3、D c 4 C L 1 2在胡萝卜叶片及肉质根中均有表达,而 D c 4 C L 8则主要在叶片中表达,推测 D c 4 C L 8发挥功能的主要部位可能是叶片。水稻中5个 4 C L基因的表达在不同发育阶段有差异,但组织特异性不明显2 8。在水曲柳中鉴定到的1 2个 4 C L基 因 其 表 达 具 有 明 显 的 组 织 特 异性2 9。毛竹的1 5个 4 C L基因中,有7个成员在 A.进化树、m o t i f及基因结构分析;B.保守结构域分析;箭头标示的为催化活性位点A.P h y l o g e n e t i c t r e e,m o t i f a n d g e n e s t r u c t u r e a n a l y s i s;B.C o n s e r v e d d o m a i n a n a l y s i s;A r r o w i n d i c a t e s t h e c a t a l y t i c s i t e图4 D c 4 C L进化关系及结构分析F i g.4 P h y l o g e n e t i c t r e e a n d s t r u c t u r a l a n a l y s i s o f D c 4 C L17319期张新业等:胡萝卜 4 C L基因家族的鉴定及分析 AC.D c 4 C L 3、D c 4 C L 8、D c 4 C L 1 2组织表达模式分析;DF.D c 4 C L 3、D c 4 C L 8、D c 4 C L 1 2胁迫响应分析;不同的大写字母表示差异极显著(P0.0 1);不同的小写字母分别表示差异显著(P0.0 5)A-C.T i s s u e e x p r e s s i o n p a t t e r n a n a l y s i s o f D c 4 C L 3,D c 4 C L 8 a n d D c 4 C L 1 2;D-F.R e s p o n s e t o s a l t a n d c h i l l i n g s t r e s s o f D c 4 C L 3,D c 4 C L 8,D c 4 C L 1 2;d i f f e r e n t u p p e r c a s e l e t t e r s i n d i c a t e e x t r e m e l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s(P0.0 1);d i f f e r e n t l o w e r c a s e l e t t e r s i n d i c a t e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s(P0.0 5)图5 D c 4 C L基因家族成员表达分析F i g.5 E x p r e s s i o n a n a l y s i s o f D c 4 C L各组织中均能检测到,为组成型表达,另外8个成员在不同组织间的表达量差异较大,具有一定的特异性7。前人研究表明,植物 4 C L基因能够响应逆境胁迫6。S u n等5研究了棉花 4 C L基因家族在冷、热、干旱和盐4种胁迫条件下的转录情况,发现有2 6个 G h 4 C L基因可受到一种或多种胁迫处理的诱导。桑树(M o r u s a l b a)4个 4 C L基因(M a 4 C L 1 M a 4 C L 4)的表达可受到UV诱导,但在N a C l胁迫后其根中 M a 4 C L 4则下调表达3 2。低 温 处 理 可 使 黄 瓜(C u c u m i s s a t i v u s)4 C L基因(C s a V 3_7 G 0 3 1 6 2 0、C s a V 3_7 G 0 3 1 6 1 0)表达升高3 4。盐胁迫处理6 h后,毛白杨(P o p u-l u s p r u i n o s a)4 C L 2基因表达升高,而在毛果杨中,该基因表达显著降低3 5。同一材料的不同4 C L家族成员在应对胁迫条件时的响应可能存在差异。如对橙子(C i t r u s s i n e n s i s)进行缺硼处理后,其 C s 4 C L 1、C s 4 C L 2、C s 4 C L 3基因的表达变化情况各不相同3 6。另外,即使是同一植株的不同部位对同一胁迫条件的反应亦可能不同。如在接种大丽轮枝菌1 2 h后,棉花感病品种根中 G h 4 C L 3 0基因的表达量有轻微升高,而在茎中该基因的表达量降低1 4。本研究对胡萝卜幼苗进行了盐胁迫和4 胁迫处理,两种处理均可使 D c 4 C L 3、D c 4 C L 8、D c 4 C L 1 2的表达量降低。本研究在全基因组水平上对胡萝卜 4 C L基因进行了鉴定,并对其进行了生物信息学分析及表达分2731西 北 农 业 学 报3 2卷析,对胡萝卜木质素含量的分子调控及遗传改良具有参考价值。参考文献 R e f e r e n c e:1 陈皓炜,陈梦娇,王雅慧,等.盐胁迫下胡萝卜肉质根中木质素响应机理研究J.园艺学报,2 0 2 1,4 8(1):1 5 3-1 6 1.C HE N H W,C HE N M J,WANG Y H,e t a l.R e s e a r c h o n t h e r e s p o n s e m e c h a n i s m o f l i g n i n i n c a r r o t t a p r o o t u n d e r s a l t s t r e s sJ.A c t a H o r t i c u l t u r a e S i n i c a,2 0 2 1,4 8(1):1 5 3-1 6 1.2 F E N G H,XU L,WAN G Y,e t a l.I d e n t i f i c a t i o n o f c r i t i c a l g e n e s a s s o c i a t e d w i t h l i g n i n b i o s y n t h e s i s i n r a d i s h