槲皮素对阿霉素所致肾病综合征大鼠的保护作用及机制.pdf

山 东 科 学 第 卷 第 期 年 月出版.:./.【药理与毒理】收稿日期:作者简介:宋泽宇()男硕士研究生研究方向为创新药物的开发研究:.通信作者范华英()女博士教授研究方向为创新药物的开发研究:.槲皮素对阿霉素所致肾病综合征大鼠的保护作用及机制宋泽宇李振元潘涛孟祥婷李淞董海轮范华英(烟台大学 药学院 分子药理和药物评价教育部重点实验室山东 烟台)摘要:探讨槲皮素对肾病综合征模型大鼠的保护作用 选用 级雄性大鼠单次尾静脉注射阿霉素./诱导肾病综合征大鼠模型收集尿液测定 尿蛋白检测血液生化血清总蛋白和白蛋白、总胆固醇、甘油三酯以及肾功能尿素氮和血肌酐的含量 染色观察肾组织病理变化透射电镜观察肾足细胞超微结构变化 检测肾组织、和 的表达 结果表明:槲皮素能有效缓解肾病综合征模型大鼠的 尿蛋白明显改善各项血液生化指标和肾功能损伤减轻肾组织病理变化和肾足细胞的足突融合同时槲皮素可以降低 的表达并提高 和 的表达 槲皮素可有效治疗阿霉素诱导的肾病综合征模型大鼠其可能通过稳定足细胞正常结构和功能发挥保护作用关键词:槲皮素肾病综合征阿霉素蛋白尿足细胞中图分类号:.文献标志码:文章编号:()开放科学(资源服务)标志码():().()./.().山 东 科 学 年 .肾病综合征()是肾内科最常见的慢性肾病()临床上主要表现为大量尿蛋白、低白蛋白血症、高脂血症和水肿 有研究表明 患病率逐年上升全球总患病率为.而中国患者高达.根据改善全球肾脏病预后组织(:)实践临床指南目前主要采用糖皮质激素类药物进行治疗 但在长期和大剂量使用此类药物治疗的过程中往往会伴随着严重的不良反应且还有部分患者存在对药物治疗无效的问题严重影响了患者的生活质量 因此寻找新的治疗药物和策略以期提高治疗 的疗效和减少治疗过程中的不良反应对于临床治疗 具有重要意义槲皮素是一种植物天然黄酮醇类化合物广泛存在于各种中草药中具有广泛的药理活性包括抗氧化、抗炎、抗凋亡和抗纤维化等 近些年的研究表明槲皮素可用于抗糖尿病、抗高血压病和抗微生物感染等疾病的治疗当中且可以通过减轻多种肾脏疾病中的肾毒性、细胞凋亡、纤维化和炎症来保护肾脏其在多种 的防治中有着广泛的应用 但槲皮素对 是否有保护作用及其作用机制尚不清楚因此本研究以与临床 相似的阿霉素肾病大鼠模型为研究对象探讨槲皮素在 中的有益作用及潜在机制为槲皮素的临床用药和 治疗的新方法、新策略提供理论依据 实验部分.实验材料.实验动物雄性的 大鼠()只()购自济南朋悦实验动物繁育公司合格证编号(鲁)实验大鼠均在()湿度 的条件下饲养给予足够的饲料和饮水适应性饲养 后进行实验 本研究经过烟台大学动物伦理委员会批准()实验方案严格按照烟台大学动物伦理委员会的相关规定设计.实验仪器全自动血生化分析仪(美国雅培公司)型离心机(赛默飞世尔科技有限公司)型超灵敏化学发光成像分析仪(美国通用医疗有限公司)电子天平(上海舜宇恒平科技有限公司)低温型研磨仪(武汉赛维尔生物科技有限公司)型酶标仪(美国 公司)透射电子显微镜(日本电子株式会社)大鼠代谢笼(上海玉研科学仪器有限公司).实验试剂槲皮素(纯度)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司阿霉素(注射用盐酸多柔比星)购自深圳万乐药业有限公司批号 规格 /支醋酸泼尼松片购自浙江仙琚制药股份有限公司批号规格 /片(二辛可宁酸测定)蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术有限公司、和 多克隆抗体购自 .实验方法.动物分组适应性饲养一周的 大鼠 只采用随机对照表按照大鼠的体质量随机分为 组:正常对照组、模型第 期宋泽宇等:槲皮素对阿霉素所致肾病综合征大鼠的保护作用及机制组、./泼尼松组、/槲皮素组、/槲皮素组和 /槲皮素组每组 只 以上分组实验用的剂量均以药物成分含量进行计算设计.实验造模及给药通过单次尾静脉注射阿霉素./正常对照组注射等体积生理盐水 注射阿霉素当日记为实验第 第 时开始给予泼尼松和不同剂量槲皮素灌胃()正常对照组:以等体积.羧甲基纤维素钠水溶液灌胃()模型组:以等体积.羧甲基纤维素钠水溶液灌胃()泼尼松组:将醋酸泼尼松片溶于.羧甲基纤维素钠溶液中配制成醋酸泼尼松混悬液按照./的剂量灌胃()/槲皮素组、/槲皮素组和 /槲皮素组:将槲皮素溶于.羧甲基纤维素钠水溶液中配制成 /的槲皮素混悬液按照大鼠的体重调整相应的剂量灌胃.检测指标.尿蛋白含量测定用大鼠代谢笼收集第、的 尿液 收集尿液后记录尿量并在 的条件下离心 留取上清液使用 蛋白定量试剂盒对尿蛋白进行定量.血液生化和肾功能检测实验结束后各组大鼠称重后麻醉取大鼠腹主动脉血液静置 在 的条件下离心 取上清液用全自动血生化检测仪检测血清总蛋白、白蛋白、总胆固醇、甘油三酯、尿素氮和血肌酐的含量.肾组织病理学检查用动脉夹将肾动脉夹住后摘取大鼠双侧肾脏将右侧肾脏纵向切开一部分固定在 多聚甲醛溶液中梯度脱水透明浸蜡包埋制成组织蜡块 经苏木精伊红()染色后观察肾组织病理学形态变化.肾组织超微结构检查另一部分肾组织切取多个约 的立方体块状固定在预冷的.固定液()中 在.戊二醛溶液、四氧化锇溶液中依次固定然后梯度脱水、包埋、切片 柠檬酸铅和双氧铀对切片进行染色后置于透射电镜下观察.、和 蛋白含量测定取 肾组织加入 裂解液超声破碎后于 、/条件下离心 取上清液 法进行蛋白定量 每组蛋白样品在 进行电泳分离蛋白并转移至 膜室温封闭 一抗于 过夜孵育 洗膜 次二抗于室温孵育 洗膜 次最后超敏 化学发光显影.统计学方法本实验使用统计学软件 .对数据进行处理计量资料以均值标准差()来表示 采用 进行组间比较分析.为差异有统计学意义 结果.槲皮素对大鼠 尿液中尿蛋白定量的影响槲皮素对大鼠尿蛋白定量的影响如表 所示 单次尾静脉注射肾上腺素后大鼠尿蛋白定量逐渐增加实验第 模型组和各给药组大鼠尿蛋白定量显著高于正常对照组(.)经药物干预后泼尼松、/槲皮素和 /槲皮素可降低实验第、大鼠尿蛋白定量显著低于模型组(.)其中/槲皮素和泼尼松的降尿蛋白效果相当山 东 科 学 年表 槲皮素对大鼠 尿液中尿蛋白定量的影响()()组别 尿蛋白定量/第 第 第 第 第 正常对照组.模型组.泼尼松组./槲皮素组./槲皮素组./槲皮素组.注:表示与正常对照组相比.表示与模型组相比.槲皮素对大鼠血液生化指标含量的影响大鼠血液生化指标如表 所示 与正常对照组相比模型组大鼠血清总蛋白含量明显下降(.)且血清白蛋白含量也明显下降(.)同时模型组大鼠还伴有总胆固醇含量明显升高(.)以及甘油三酯含量明显升高(.)表 槲皮素对大鼠血液生化指标含量的影响()()组别总蛋白质量浓度/()白蛋白质量浓度/()总胆固醇浓度/()甘油三酯浓度/()正常对照组.模型组.泼尼松组./槲皮素组./槲皮素组./槲皮素组.注:表示与正常对照组相比.表示与模型组相比.表示与模型组相比.槲皮素对大鼠血清尿素氮和血肌酐含量的影响血清尿素氮和血肌酐是反应肾功能的常用指标因此本实验检测了大鼠血清中的尿素氮和血肌酐含量进而评估槲皮素对大鼠肾功能的影响结果如表 所示 与正常对照组相比模型组大鼠血清中尿素氮含量明显升高(.)且血肌酐的含量也明显升高(.)与模型相比泼尼松和 /槲皮素明显降低了尿素氮和血肌酐的水平 这表明 /槲皮素可一定程度保护肾功能表 槲皮素对大鼠血清尿素氮和血肌酐含量的影响()()组别尿素氮浓度/()血肌酐浓度/()正常对照组.模型组.泼尼松组./槲皮素组./槲皮素组./槲皮素组.注:表示与正常对照组相比.表示与模型组相比.表示与模型组相比.第 期宋泽宇等:槲皮素对阿霉素所致肾病综合征大鼠的保护作用及机制.槲皮素对大鼠肾脏病理形态变化的影响通过 染色观察槲皮素对大鼠肾组织病理形态变化的影响结果如图 所示 正常对照组肾组织结构正常经肾上腺素注射后模型组肾小管内可见大量蛋白管型(图中黑色箭头所示)肾小管上皮细胞空泡样变(图中蓝色箭头所示)肾小管扩张且肾小球囊腔增宽(图中红色箭头所示)与模型组相比较泼尼松组和 /槲皮素组大鼠肾脏未见明显病变表明肾脏损伤得到明显改善/和 /槲皮素对大鼠肾脏损伤改善效果不佳图 槲皮素对大鼠肾脏病理形态变化的影响(染色).().槲皮素对大鼠肾组织超微结构变化的影响为了评价槲皮素对大鼠肾组织中足细胞结构的影响通过电镜观察足细胞超微结构的变化结果如图 所示 正常对照组足细胞足突结构完整突触间隙清晰模型组可见足突广泛融合突触间隙消失(图中黑色三角所示处为典型的足细胞融合区域)与模型组相比经泼尼松干预后足突融合明显得到改善且突触间隙也较明显而不同剂量的槲皮素不同程度改善了足细胞足突融合的现象其中 /槲皮素的效果最佳图 槲皮素对大鼠肾组织足细胞超微结构变化的影响.山 东 科 学 年.槲皮素对大鼠肾组织、和 蛋白表达的影响为了进一步探讨槲皮素对足细胞的影响检测了肾组织当中、和 蛋白表达结果如图 所示 与正常对照组相比模型组大鼠、表达水平明显降低 表达水平明显升高与模型组相比各给药组、表达水平呈现不同程度升高 表达水平呈现不同程度降低其中以泼尼松组和 /槲皮素组效果较好注:表示与正常对照组相比.表示与模型组相比.表示与模型组相比.图 槲皮素对大鼠肾组织、和 表达水平的影响().()讨论阿霉素诱导的大鼠肾病模型是公认的能较好模拟人类 的模型 研究表明阿霉素经尾静脉注射入大鼠体内后能迅速分布到肾脏组织一方面在体内产生活性氧导致肾小球滤过膜结构和功能的破坏另一方面阿霉素能嵌入 而抑制 的合成造成含有、的细胞器损伤引起肾组织的代谢异常最终导致大鼠出现与 临床相似的症状即尿蛋白排泄增加、血清白蛋白和总蛋白降低以及血脂异常等 阿霉素由于其严重的消化道毒副作用剂量过高常引起大鼠严重腹泻大鼠的死亡率较高 因此国内外学者对阿霉素的剂量做了探讨如./、./、./等发现./的阿霉素剂量不能够引起明显的 症状而./和./的阿霉素便能很好地复制出 大鼠模型为了降低严重的毒副作用本实验选择了一次性尾静脉注射./阿霉素复制大鼠 的模型 实验结果表明大鼠注射阿霉素后 尿蛋白定量逐渐升高血清总蛋白和白蛋白含量明显降低还伴随总胆固醇和甘油三酯的含量异常升高反映出模型大鼠出现血脂和血清蛋白异常同时尿素氮和血肌酐反映肾功能出现明显异常且肾脏病理显示模型组大鼠出现肾小管变性和扩张、肾小管内可见大量蛋白管型以及肾小球囊腔增宽现象 以上结果符合临床 的特征和病理表现表明阿霉素 大鼠模型复制成功可以进行后续的槲皮素干预实验 槲皮素是一种植物类黄酮广泛存在于中草药中具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗菌、抗纤维化等作用 已有研究报道槲皮素在治疗慢性肾脏疾病方面是有效的但槲皮素是否对肾病综合征有治疗作用尚不清楚 本实验采用阿霉素成功复制出大鼠 模型经药物治疗后泼尼松显示出第 期宋泽宇等:槲皮素对阿霉素所致肾病综合征大鼠的保护作用及机制良好的治疗效果不同剂量的槲皮素也对 大鼠症状显示出不同程度的缓解作用其中以 /的槲皮素治疗效果最佳 应用 /槲皮素治疗后有效降低了大鼠 尿蛋白的排泄伴有血脂和血清蛋白的异常也得到缓解最终减缓了 病理进程的发展蛋白尿不仅是 主要临床特征也是促进疾病进展快慢的危险因素 近年来研究表明漏出的蛋白尿可以导致肾小管、肾间质等继发性损伤是肾小球滤过膜损伤的结果 足细胞、肾小球内皮细胞和肾小球基底膜共同构成肾小球滤过屏障而足细胞相邻足突之间相互咬合构成肾小球滤过膜最后一道屏障当足突结构受损大量大分子漏出形成蛋白尿 本实验中阿霉素诱导的大鼠肾组织足细胞超微结构出现足突广泛融合突触间隙明显消失这与 和 的表达异常有关 和 分布于足细胞间的裂孔隔膜区域维持足突结构的正常功能是肾小球滤过膜的主要成分 经槲皮素治疗后大鼠肾组织中 和 表达均得到不同程度上调恢复足突正常排列形态 同时槲皮素有效抑制足细胞损伤标志蛋白 的表达 由此推测槲皮素可以减轻足突融合有效修复足细胞损伤以此恢复肾小球滤过膜结构和功能的完整性发挥减少尿蛋白的作用综上所述槲皮素可有效缓解阿霉素诱导的大鼠 症状其中以 /槲皮素的效果最佳 其作用机制可能是通过上调 和 并降低 的表达稳定足细胞正常结构和功能实现本实验结果显示槲皮素在治疗 方面有着广阔的应用场景为临床上治疗 的新策略和药物开发提供了实验依据参考文献:.():.:./.():.():.:./().:.()():.:./().():().():.:./.():.:./.():.:./().:.:.:./.:.:./.():.:./.:.():.:./.山 东 科 学 年 .:.:./.:.()():.:./.():.:./.包玉龙 杨瑞 刘禾 等.阿霉素大鼠肾病综合征模型最佳剂量的筛选.动物医学进展 ():.:./.():.:./.唐桂毅 温和 王晶晶 等.阿霉素肾病大鼠模型的评价研究.药物评价研究 ():.:./.:.():.:./.():.:./.():.:./.:.:.:./.:.:./.:.:.:./.