基因测序实验室污染情况调查及不同核酸污染去除方法效果比对.pdf

医学检验与临床2 0 2 3年第34卷第8 期Medical Laboratory Science and Clinics,2023,Vol.34,No.867doi:10.3969/j.issn.1673-5013.2023.08.016基因测序实验室污染情况调查及不同核酸污染去除方法效果比对任清霞1韩文举2 苏彤高艳2 41（日照市人民医院生殖医学科，山东日照2（日照市人民医院检验科，山东日照2 7 6 8 0 0）276800)摘要 目的：对基因测序实验室核酸污染情况进行调查，探讨污染的原因，避免污染的产生，同时对污染的消除方法进行比对，总结最优核酸去除方法。方法：对进行完基因扩增的实验室进行采样检测，评估污染效果，对污染严重的物品采用五种不同的消毒方法进行处理，比对消毒效果。结果：基因测序实验室，测序结束后能对周围的实验环境造成大量的污染，五种常见的消毒效果中，8 4消毒剂和DNAAWAY核酸去除剂效果较好，紫外照射、通风和7 5%酒精效果较差。结论：基因测序实验室人员应加强培训，尽量减少污染的产生，每次建库结束必须采用有效的方法进行消毒，消毒后必须进行采样检测，确保污染去除后才能再次使用。关键词新冠；测序；核酸污染；实验室消毒新型冠状病毒肺炎（简称新冠肺炎）是一种新发急性呼吸道传染病，被世界卫生组织列为“国际关注的突发公共卫生事件”。我国于2 0 2 0 年1月2 0 日将其纳人法定传染病乙类传染病，按甲类管理2，目前对新冠病毒的防控，实验室核酸检测为最主要的监测和发现方法3，针对新冠病毒的基因测序也被越来越多的应用于实际的疫情处置中，在疫情处置中发挥了重大的作用4-5，并被更多的应用于以后的疫情处置中。但是相对于日常的核酸检测，基因测序过程的文库构建需要反复对扩增产物进行开盖操作和扩增产物的纯化，较普通的PCR更容易产生实验室污染回，而基因测序技术相对复杂，现有的实验室人员对该技术经验和技术还处于探索和积累的过程，因此摸清基因测序实验室的污染状况及污染消除方法成为目前呕需跟进的工作之一，本文针对连续完成几次新冠测序实验之后的实验室，对可能污染的物品进行了涂抹检测污染，对实验室的污染状况做整体的了解，并对污染的物品及表面，采取多种消毒方法进行处理，评价不同的消毒试剂对核酸污染的消除效果。1资料与方法1.1 主要的试剂核酸提取试剂为天隆公司的全自动核酸提取仪及配套试剂，扩增试剂为上海伯杰公司出品的新冠病毒核酸检测试剂盒，采样拭子为友康公司出品的病毒采样管，消毒试剂分别为：7 5%酒精、8 4消毒液、DNAAWAY核酸去除剂。1.2主要的方法1.2.1核酸污染的调查方法对刚做完大批量基因测序任务的实验室，不进行消毒直接进行采样，一次采样用三根采样拭子，用采样液湿润后对可能污染的样品进行涂抹采样后，按照新冠病毒核酸检测标准流程进行核酸提取和扩增。采集的物品有：加样枪外表面（2 0 2 0 0 1量程、A通讯作者：高艳，E-mail：d o u j i a 2 0 0 7 16 3.c o m。68210l量程、10 10 0 1量程）、生物安全柜内表面、生物安全柜内铺巾、EP管架表面、试管架表面、振荡器表面、微型离心机表面，同时采样过程设空白管作为采样及提取的阴性对照，扩增过程采用试剂盒内置阴性质控品作为阴性对照。1.2.2核酸残留去除方法调查对存在污染的最为严重的台面铺巾裁剪为五块，分别采用7 5%的酒精喷洒消毒30 min后涂抹采样，84消毒液（浓度10 0 0 mg/mL）喷洒消毒30 min后涂抹采样，紫外照射1h后采样涂抹，DNAAWAY核酸去除剂喷洒30 min后涂抹采样，空气通风暴露一周后进行涂抹采样，按照新冠病毒核酸检测标准流程进行核酸检测。2结果2.1实验室污染情况调查结果采样和核酸提取阴性对照、扩增阴性对照结果均为阴性，除此之外加样枪外表面（2 0 2 0 0 1量程、2101量程、10 10 0 l量程）、生物安全柜内表面、生物安全柜内铺巾、EP管架表面、试管架表面、振荡器表面、微型离心机表面均检测出高浓度含量的核酸污染物，根据基因测序实验室物体表面污染物核酸浓度检测结果判定，污染严重程度由高到低依次为：生物安全柜铺巾2 0 2 0 0 1加样枪 EP管架 10 10 0 1量程加样枪 振荡器 生物安全柜内表面 2 10 1加样枪 微型离心机 试管架 其他操作台面，见表1。2.2不同核酸去除方法效果评价通过对五种核酸去除效果的效果比对，空气通风暴露、7 5%酒精喷洒、紫外照射1h效果均无法完全清除核酸污染，和未处理的结果相比，仅能使结果增加1 2 个Ct值。10 0 0 mg/mL的8 4消毒液和DNAAWAY核酸去除剂效果比较好，处理后的检测结果表1基因测序实验室物体表面污染检测结果及不同方式处理后的检测结果生物安全柜2 0 2 0 0 1生物安全柜2 10 l微型Ct值EP管架铺巾加样枪处理前29.2空气通风后30.175%酒精喷洒后31.0紫外照射1h后31.284消毒液处理后NoCt核酸去除剂处理后NoCtMedical Laboratory Science and Clinics,2023,Vol.34,No.8投人使用。10100 1振荡器量程加样枪内表面加样枪离心机29.931.232.232.432.531.933.132.1NoCtNoCtNo CtNoCtNoCtNo CtNoCtNoCtNoCtNoCtNoCtNoCt医学检验与临床2 0 2 3年第34卷第8 期为阴性，见表1。3讨论进人2 0 2 2 年后，新冠疫情在国内多地散发，2019年末-2 0 2 0 年初的疫情都有明确的传播源、传播途径，该轮疫情与之不同，很多病例无明确的流行病学关联，采用传统的流调方法很难准确判定病毒来源，因而基因测序实验在这方面的优势在该轮疫情中发挥了极其重要的作用7-9。但是相对于新冠病毒的核酸检测，基因测序实验目前仍属于难度较高的实验，有经验的实验人员数量极其有限，大多数一线实验人员目前仍属于经验积累的过程，且基因测序实验需要手工操作的步骤多，过程复杂，中间有数次对高浓度、高纯度的扩增产物的开盖纯化操作，极容易产生气溶胶污染，通过该次污染调查，也证实了基因测序后的确造成了大规模的实验室污染，因而有必要提示现有的同时开展核酸检测和基因测序的实验室，需要严格注意核酸污染，测序实验室和核酸检测实验室的物品严禁混用。针对基因测序实验室的污染，目前常用的消毒方法为实验室通风、7 5%酒精喷洒消毒、8 4消毒剂喷洒消毒、紫外线照射消毒，DNAAWAY核酸去除剂这几个方法，但是通过该次实验发现，对于高浓度的实验室核酸污染，通风、紫外照射1h、7 5%酒精效果均不明显，8 4消毒剂和DNAAWAY核酸去除剂效果相对较好，和其他研究结果类似U，但DNAAWAY核酸去除剂价格相对较贵，限制了其在日常的大量使用，紫外照射目前相关研究认为对核酸污染也有一定的效果，但是对50 0 bp以上长片段效果明显，对短片效果欠佳叫，在日常的实验室消毒处理时，可采用多种方式组合的方式进行。实验室消毒结束后必须对消毒效果进行再次采样评价后方可再次其他试管架操作台面31.932.133.132.032.932.433.232.8NoCtNoCtNoCtNoCtNoCtNoCt32.633.133.534.133.633.934.034.133.934.634.935.234.135.335.234.934.936.035.935.8医学检验与临床2 0 2 3年第34卷第8 期参考文献1 World Health Organization.Statement on the secondmeeting of the International Health Regulations(2005)Emergency Committee regarding the outbreakof novel coronavirus(2019-nCoV)EB/OL.2022-04-09.2中华人民共和国国家卫生健康委员会公告2 0 2 0-1-302022-04-09EB/OL.3关于印发新型冠状病毒肺炎防控方案（第八版)的通知EB/OL2021-05-142021-04-09.4王晶,陈华凤,阳世雄,等.广西1例本地新冠肺炎病例感染的溯源调查).病毒学报,2 0 2 2,38(0 1):33-40.5王建醒,刘调,姚明晓,等.山东省新型冠状病毒分离与全基因组进化分析.中华实验和临床病毒学杂志,2 0 2 1,35(0 6):6 6 9-6 7 4.Medical Laboratory Science and Clinics,2023,Vol.34,No.8696周娟.高通量测序捕获建库技术研发及其在复杂疾病分子遗传学研究中的应用D.上海交通大学,2 0 2 0.7日照疫情防控最新情况：19 份阳性样本属于同一传播链2 0 2 1-11-17 2 0 2 2-0 4-10 EB/OL.8青岛三起疫情测序结果与我国本土和入境人员病例基因库均不同源2 0 2 2-0 3-13 2 0 2 2-0 4-10 EB/OLJ.9李世康,张亚娜.湖南疾控完成两例奥密克戎新冠病毒基因组序列测定N.大众卫生报,2 0 2 1-12-2 3(0 0 1).10李云龙,张健,魏艳秋,等.分子诊断实验室去除核酸污染的方法学研究.生物工程学报,2 0 2 1,37(0 2)：673-679.11龚文娟,陈宝荣,孙慧颖,等.新型冠状病毒核酸检测阳性质控品污染原因分析及解决办法.中华临床实验室管理电子杂志,2 0 2 1,9(0 4):2 37-2 41.(上接第58 页）7徐亚玲,常颖,陈叙.妊娠期糖尿病孕妇妊娠晚期血脂及凝血功能指标检测结果分析.中国妇幼保健，2017,32(5):951-954.8 赵嵩,杨雪娇.VCAM-1和AOPP与妊娠期糖尿病患者母婴结局的关系研究.西南国防医药,2 0 18,28(3):215-218.9 杨怡珂,丁新.妊娠期血脂的相关研究进展.医学综述,2 0 17,2 3(15):30 0 2-30 0 7.10刘文波,王燕侠,焦新娟,等.不同妊娠阶段血脂水平变化与早产结局的关联研究.中国妇幼保健,2 0 2 2,37(13):2361-2364.11王宏宇,付茜,苏福祥.载脂蛋白B/载脂蛋白A1比值与急性冠脉综合征患者冠状动脉多支病变及斑块易损性的相关性.中国医科大学学报,2 0 2 2,51(7):577-582.12南楠,左惠娟,周渊,等.比较3种不同指南/共识评价极高风险或超高危动脉粥样硬化性心血管疾病危险分层和血脂达标率差异.中华内科杂志,2 0 2 2,61(4):377-383.13王露朝,柴小奇,陈玉军,等.血浆致动脉粥样硬化指数与2 型糖尿病患者并发冠心病及其冠状动脉狭窄程度的关系研究.实用心脑肺血管病杂志,2 0 2 0,28(6):22-27,35.14 杨旭,齐俊巧,郭丽魁,等.妊娠高血压病血脂与红细胞压积水平特点及其对妊娠结局的影响研究.中国实验诊断学,2 0 2 0,2 4(2):2 54-2 56.15于津,孙峰,郭玉娜,等.妊娠早期同型半胱氨酸和血脂水平对重度子痫前期的预测价值.国际妇产科学杂志,2 0 18,45(1):51-54,8 4.16刘星娅,龙金晶,钟新丽,等.辅助性T淋巴细胞1/辅助性T淋巴细胞2、载脂蛋白A1、T-钙黏蛋白在早发型重度子痫前期期待治疗中的动态变化及其对终止妊娠的指导作用.中国性科学,2 0 2 2,31(3):55-58.17林楠,顾玮,华人意,等.孕早期血脂水平与子痫前期的相关性D.上海大学学报（自然科学版),2 0 19,2 5(1):18-23.