基因测序技术在单基因狼疮精准诊断和机制研究中的应用现状.pdf

715 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 9 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.9 Sep.2023基因测序技术在单基因狼疮精准诊断和机制研究中的应用现状杨智博1,2 刘 力11.天津市儿童医院 天津大学儿童医院综合内科（免疫）（天津 300074）；2.天津医科大学研究生院（天津 300070）摘要：单基因狼疮是一类表现为狼疮样症状的自身免疫性疾病总称，通常在儿童时期即被确诊。尽管单基因变异导致系统性红斑狼疮较罕见，但了解其原理有助于临床医师深刻理解系统性红斑狼疮。近年来，随着基因测序普遍应用，许多新变异被发现。本文从已知变异位点及致病途径进一步理解单基因狼疮，以期为狼疮患者寻找更精准的诊断标志物和制定更具个性化的治疗方案提供新的发展方向，也为该类疾病新药的研发提供可能的靶点。关键词：单基因狼疮；全基因组测序技术；系统性红斑狼疮；变异Application of gene sequencing technology in precise diagnosis and mechanism research of monogenic lupus YANG Zhibo1,2,LIU Li1(1.Department of General Medicine(Immunology),Tianjin Childrens Hospital,Childrens Hospital of Tianjin University,Tianjin 300074,China;2.Graduate School of Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China)Abstract:Monogenic lupus is a general term for a class of autoimmune diseases with lupus like symptoms,which is usually diagnosed in childhood.Although it is rare for a single gene variant to cause systemic lupus erythematosus(SLE),understanding its principle is helpful for clinicians to gain a deep understanding of SLE.In recent years,with the widespread application of gene sequencing,many new variations have been discovered.This review is to further understand monogenic lupus from known variations and pathogenic pathways,in order to provide a new development direction for patients with lupus to find more accurate diagnostic markers and formulate more personalized treatments,and also to provide possible targets for the research and development of new drugs for such disease.Key words:monogenic lupus;whole genome sequencing;systemic lupus erythematosus;variationdoi:10.12372/jcp.2023.22e1331 讲座 单基因狼疮是单基因变异引起的一类表现为狼疮样症状的自身免疫性疾病总称，多呈早发趋势，通常由儿童免疫科医师确诊。尽管该病因只占系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）发病的很小一部分，但了解其机制有助于临床医师深刻理解并精准诊疗SLE。单基因狼疮患者的临床症状与其他SLE患者不同，以中枢神经系统疾病和皮肤症状为主，尤其是单基因狼疮患者会出现皮肤冻疮样皮损1。当患者临床症状不典型时，精确诊断仍需基因测序。相关研究指出，已有30多个单基因的100多个位点变异可致SLE表型1。这些发现加深了临床医师对于SLE的理解，但其他未知的变异也是未来需研究的方向。有研究认为，SLE患者早发型或反复感染都应进行免疫检查和基因检测2。本文将从单基因狼疮概念，基因测序技术应用，以及单基因狼疮致病机制等方面进行分析，以期为其精准诊断和治疗提供方向。1 单基因狼疮概念与诊断单基因狼疮是 SLE 中较为少见的分支，通常在儿童期发病，与家族遗传高度相关。研究表明，89.8%的患者符合欧洲抗风湿联盟/美国风湿病学会（EULAR/ACR）-2019诊断标准，而93.9%患者符合系统性红斑狼疮国际临床协助组（SLICC）-2012基金项目：天津市医学重点学科（专科）建设项目资助（No.TJYXZDXK-040A）通信作者：刘力 电子信箱：may13_ 716 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 9 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.9 Sep.2023诊断标准3，提示仅依据现有诊断标准判断SLE患者是否为单基因变异所致很困难。但有研究发现，当SLE患者满足以下条件时，应高度怀疑单基因狼疮：早发型狼疮，首发年龄1:1000）的儿童，尤其是发病初症状非典型的，如复发性肺炎和支气管扩张，也应该考虑C4缺乏型单基因狼疮11。总之，单基因变异引起的补体系统缺陷很可能导致患者表现为狼疮，通常早发、严重且可追溯家族史，变异引起细胞清除异常是导致单基因狼疮的主要致病机制之一。717 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 9 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.9 Sep.20233.1.2 核酸降解相关酶缺陷 基因组广泛关联研究（genome wide association studies，GWAS）已发现30多个单基因的100多个位点变异导致SLE表型，如TREX1、SAMHD1、DNASE1、DNASE1L3、TMEM 173 等，与单基因 SLE 的脱氧核糖核苷酸1（deoxyribonuclease 1，DNASE1）密切相关，脱氧核糖核苷酸1样3（deoxyribonuclease 1 like 3，DNASE1L3）基因编码的主要酶可以分裂单链和双链DNA，并从病原体和凋亡细胞中去除外源DNA和自体DNA12。DNASE1/DNASE1L3基因缺陷导致细胞外核酸的积累，血浆中低于120bp的短DNA分子数量增加与抗dsDNA抗体的存在有关13，而携带长DNA分子的微粒具有免疫原性，与其相关的抗原可能会造成狼疮肾损害14。这些胞外累积的核酸也可被toll样受体（TLR7和TLR9）等DNA/RNA传感器识别，导致IFN-1的过度生成，从而导致单基因狼疮。有学者认为，症状早发、肺出血、肾小球肾炎、复发性荨麻疹和抗中性粒细胞抗体（ANCA）阳性等表现提示临床上要警惕单基因狼疮，特别是青少年SLE中DNASE1L3缺陷的单基因狼疮15。基因测序应用有助于发现这些基因变异位点。3.2 干扰素过度产生IFN 是可以限制病毒复制组装的抗病毒细胞因子。尽管IFN-1可以保护机体免受病毒侵害，但IFN-1的过度产生同样会使患者出现单基因狼疮。IFN-1的过度表达可以通过以下机制发生：核酶活性的缺陷（TREX1、SAMHD1、ADAR1、RNASEs、DNASEs），IFN信号抑制调控因子的缺陷（ISG15、USP18）和先天免疫传感器的组合活化（MDA5、RIG-I、STING）等 1。IFN-1 与异二聚体受体（IFNAR 1和IFNAR 2）结合，激活Janus 激酶（JAK）-信号转导和转录激活因子（STAT）信号通路，诱导数百个干扰素刺激基因（interferon-stimulated gene，ISG）的转录1。这些途径的任何编码基因发生变异时都会导致IFN-1的过度表达，从而导致型干扰素疾病，如单基因狼疮。例如，Aicardi-Goutires 综合征（AGS）就是一种典型的型干扰素疾病，它是由单基因变异引起，表现为狼疮样症状的综合征。对于早发的冻疮样皮损、神经系统症状（颅内钙化、白质病变、肌张力异常）、发育迟缓、自身免疫抗体阳性、SLE临床表现不典型或常规治疗无效的SLE患者，应考虑AGS16。宿主DNA可以通过干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）变异触发胞浆内的固有传感器，并激活干扰素产生和ISG的表达上调17。所有携带DNA代谢酶的功能缺失性变异（如TREX1或SAMHD1）或DNA传感器/适配器功能获得性变异（TMEM173/STING1）的患者在AGS或婴儿发病的STING相关血管炎（SAVI）这两种疾病中都分别表现出高且持续的ISG表达17。说明了ISG的表达增加在相关疾病发病机制中的关键作用。脊椎软骨发育不良伴免疫调节异常（SPENCDI）也属型干扰素病，是一种罕见的常染色体隐性遗传的骨骼发育不良，以椎体和干骺端放射性病变为特征18，其免疫调节异常可以表现为SLE等自身免疫病。该病由抗酒石酸酸性磷酸酶5（acid phosphatase 5，ACP5）基因纯合变异导致的酒石酸抗性酸性磷酸酶（TRAP）失活所引起19，在非核酸相关的刺激/调节型干扰素途径中发挥作用18-20。当该病患者的免疫调节异常表现为狼疮时，这也是一种单基因狼疮。3.3 自身免疫耐受受损SLE患者体内广泛存在自身抗体，当某些基因变异时，自身反应性T细胞或B细胞无效清除，对其阴性选择失效就会触发自体免疫和耐受受损，从而发生自身免疫性疾病，如单基因狼疮。3.3.1 T细胞免疫耐受受损 鼠类肉瘤病毒基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）基因变异时，增强了丝裂原活化蛋白激酶信号传导通路（RAS-MAPPK）的传导信号，刺激淋巴细胞增殖，并抑制T淋巴细胞凋亡，导致单基因狼疮等症状出现，在临床上称为Noonan综合征。如NRAS、SOS1、PTPN11、RAF和SHOC2等基因变异也与Noonan综合征相关10。3.3.2 B细胞免疫耐受受损 蛋白激酶C（protein kinase C delta，PRKCD）基因编码的蛋白激酶C（PKC-）是一种促凋亡因子，作用于B细胞的凋亡。当PRKCD基因纯合错义变异时，PKC-表达降低，718 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 9 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.9 Sep.2023B细胞凋亡减少导致未成熟的B细胞过度聚集，自身抗体增多，形成免疫复合物而出现一系列自身免疫性疾病症状10。TLR7是一种病毒RNA的传感器，TLR7信号传导增强也是自身免疫性疾病的一种发病机制。相关研究发现，由于TLR7功能获得性变异引起对鸟苷的亲和力增加，TLR7激活阈值降低会导致B细胞驱动自身免疫，造成SLE等自身免疫疾病21。TLR7促进了被B细胞受体激活的高自身反应性未成熟B细胞的异常存活，并以细胞固有的方式累积CD11c+年龄相关B细胞和生发中心B细胞，滤泡和滤泡外辅助性T细胞也随之增加。虽然人类TLR7Y264H变异足以在小鼠中诱导出狼疮，但除了增加型干扰素基因转录外，对核苷酸酶H2亚基B（ribonuclease H2 subunit B，RNASEH2B）半合子没有明显的增加效应，在存在环境因素刺激的情况下，该变异在人类中的作用可能会增加，包括依赖TLR7免疫的单链RNA病毒，如新冠病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）等22。这证明了失调的TLR7能够驱动自身抗体产生和SLE的发生，或许可以为治疗单基因狼疮提供新思路。P2Y受体8（P2Y receptor family member 8，P2RY8）是一种在抑制生发中心B细胞迁移和生长调节中具有既定作用的受体，P2RY8杂合错义变异同样会对B细胞免疫耐受造成损伤并导致SLE症状。低P2RY8水平与狼疮性肾炎相关，与年龄相关B细胞和浆细胞的增加相关23。编码区变异或某些环境因素可以损害狼疮患者的P2RY8功能，导致P2RY8减少。3.4 其他单基因变异引起的狼疮有病例报道，在单基因狼疮患者中发现了脂多糖应答性米色样锚定蛋白（lipopolysaccharide-responsive beige-like anchor protein，LRBA）基因变异缺陷24。LRBA促进细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA4）表达，SLE患者的T细胞在激活时不能上调CTLA4，该通路的改变则可能是LRBA缺陷导致单基因狼疮的致病机制。某些狼疮继发于单基因变异引起的原发性免疫缺陷类疾病。如RAG1、NRAS、PIK3CD、PSYPIP1、TNFAIP3等单基因杂合变异引起原发性免疫缺陷疾病，都可能继发狼疮25。此外，胞质分裂作用因子8（dedicator of cytokinesis 8，DOCK8）缺陷导致的高IgE综合征也会表现为SLE26。4 结论与展望近年来，随着基因测序技术在 SLE 患者诊断及研究中的广泛应用，很多单基因相关的变异被发现，其中有许多罕见变异位点，也有越来越多的儿童患者及其家庭愿意参与基因测序来寻找病因，为深入了解单基因狼疮的致病机制提供了思路与方向。相关研究分析表明，罕见变异所受到连锁不平衡的影响远小于常规变异27。已有学者把已经发现的31个单基因狼疮变异位点（C1QA、C1QB、C1QC、C1R、C1S、C2、C3、TREX1、RNASEH2A、RNASEH 2 B、RNASEH 2 C、SAMHD 1、ADAR、DNASE1、DNASE1L3、PRKCD、ACP5、SLC7A7、IFIH1、TMEM173、ISG15、CYBB、FAS、FASLG、KRAS、NRAS、MAN2B1、PEPD、PTPN11、RAG2、SHOC2）作为靶向基因，运用NGS诊断自身炎性疾病。所有早发型SLE患者，无论有无家族史，都应该通过NGS检测单基因缺陷28。总之，大部分变异都是通过影响炎症通路和机体免疫调节产生自身抗体或有害炎症因子，通过其持续作用而导致自身免疫性疾病如单基因狼疮的发生。过去，狼疮的治疗药物选择有限，大多采用激素和免疫抑制剂等非特异性治疗，但随着对单基因狼疮认识的加深，既有助于更全面了解SLE这类疾病，也可为针对不同的致病途径进行精准阻断治疗提供新的方向和依据。比如，贝利木单抗是一种人源性单克隆IgG抗体，可抑制B淋巴细胞刺激因子，导致B细胞数量减少并调节其功能，可有效缓解成人SLE患者的皮肤和关节症状，也有其治疗儿童单基因狼疮患者（C1q缺陷）后关节炎症状得到完全缓解的先例，因此贝利木单抗可作为一种辅助治疗应用于难治性单基因狼疮患者29。此外还有其他治疗手段，如某病例报道中提到的，应用造血干细胞移植治疗表现为SLE的DOCK8缺陷患者26。补充 719 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 9 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.9 Sep.2023DNASE1L3也可以作为一种疗法，用来帮助该种缺陷的患者13。更有新鲜冰冻血浆和造血干细胞移植应用到C1q缺乏的早发型SLE患者中，替代由单核细胞产生蛋白缺失的先例等30。尽管已有很多前期研究，但由于该病患者基数小且大部分为儿童，诊疗与成人患者相比更具有局限性和不确定性，对单基因狼疮的认识仍不足。在未来，发现更多可能的变异位点，厘清发病机制仍是研究单基因狼疮的努力方向，精准诊疗等也需要更深入的讨论和验证。参考文献：1 Demirkaya E,Sahin S,Romano M,et al.New horizons in the genetic etiology of systemic lupus erythematosus and lupus-like disease:monogenic lupus and beyond J.J Clin Med,2020,9(3):712.2 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