鸡肉中非典型沙门氏菌标准物质的研制及其在能力验证中的应用.pdf

书书书第 卷第 期 年月计 量学报 ，：鸡肉中非典型沙门氏菌标准物质的研制及其在能力验证中的应用徐倩，刘思渊，高颖，王梓权，隋志伟，常海艳（湖南师范大学 生命科学学院，湖南 长沙 ；中国计量科学研究院，北京 ）摘要：针对目前沙门氏菌标准物质种类缺乏、研制水平有待提高的问题，选取非典型沙门氏菌 作为目标菌，产气肠杆菌 作为干扰菌，研制鸡肉中非典型沙门氏菌标准物质。结果表明，该标准物质的沙门氏菌定量标准值为（），菌落总数定量标准值为（），定性标准值为沙门氏菌阳性。均匀性和稳定性良好，可以在 下稳定保存 个月。此外，将该标准物质作为考核样品用于 家食品承检机构的沙门氏菌定性检测能力验证，其中 家结果合格，其余 家机构因非典型沙门氏菌漏检，结果不合格。制备的鸡肉中非典型沙门氏菌标准物质可以有效用于食品承检机构的沙门氏菌检测能力评价。关键词：计量学；沙门氏菌；标准物质；能力验证中图分类号：文献标识码：文章编号：（），（，；，）：，（），（），：；收稿日期：；修回日期：基金项目：国家重点研发计划（）；国家市场监督管理总局科技计划（）；中国计量科学研究院基本业务费（，）引言沙门氏菌是一种危害严重的人畜共患食源性致病菌 ，在全球范围内的食源性细菌中毒事件中有着较高的检出率 。沙门氏菌检验流程 繁琐，样品首先需要增菌，随后在选择性培养基划线接种，然后挑取可疑菌落进行生化鉴定。其中，木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（）、琼脂、亚硫酸铋琼脂（）和沙门氏菌显色培养基是国标规定的沙门氏菌选择性培养基 。然而，沙门氏菌种类繁多，目前已分离出 多种血清型沙门氏菌 ，。其中存在一类非典型的沙门氏菌 ，生化特征与典型沙门氏菌存在差异，可能无法在国标规定的选择性培养基上长出典型菌落 。考虑到多数食品承检机构 ，在实际样品检测中仅会采用 种国标规定的选择性培养基，非典型沙门氏菌存在一定的漏检风险。标准物质是指具有足够均匀和稳定的特定特性的物质，它具有准确的特性量值，能够实现测量量值的复现和传递 。沙门氏菌标准物质可以有效用于食品承检机构检测能力的评价 ，从而降低我国沙门氏菌漏检的风险。然而，国内外沙门氏菌标准物质的研制水平尚处于起步阶段 ，仅有 种通过国际或国家级组织机构认定的沙门氏菌有证标准物质（和 （），整体依旧面临着种类匮乏、非典型沙门氏菌标准物质缺失的问题，难以满足食品承检机构沙门氏菌检测能力评价的需求。此外，沙门氏菌标准物质制备的相关研究中，存在以下 个问题：第一，定值水平有待提高。先前的研究 ，仅测定了沙门氏菌标准物质的定性标准值（阳性或阴性），而未测定其定量标准值；或者定量测定结果以对数的形式体现 ，结果的精准程度有待提高。第二，均匀性和稳定性评估有待改进。微生物标准物质研制需要依据 标准物质的定值及均匀性、稳定性评估 和 能力验证提供者认可准则在微生物领域的应用说明 ，采用单因素方差分析法进行均匀性评估，采用回归曲线法结合趋势性变化分析进行稳定性评估，而先前的研究 缺乏相关的评估模型和数据。因此，针对目前沙门氏菌标准物质种类缺乏、研制水平有待提高的问题，本研究旨在研制鸡肉中非典型沙门氏菌标准物质，对其均匀性、稳定性、标准值和不确定度进行评估或评定，并将研制好的标准物质用于食品承检机构的沙门氏菌定性检测能力验证。材料与方法 材料与仪器非典型沙门氏菌菌株 ，中国计量科学研究院；产气肠杆菌 ，中国工业微生物菌种保藏管理中心；沙门氏菌冻干保护剂，中国计量科学研究院；缓冲蛋白胨水（）、四六磺酸钠煌绿增菌液（）、亚硒酸盐胱氨酸增菌（）、煌绿乳糖胆盐肉汤（）、木糖赖氨酸脱氧胆酸钠琼脂（）、琼脂、亚硫酸铋琼脂（）、平板计数琼脂（），北京陆桥有限责任公司；沙门氏菌鉴定试剂套装品，青岛海博生物技术有限公司（海博）、北京陆桥有限责任公司（陆桥）、广州环凯微生物科技有限公司（环凯）。型 电 子 天 平，德 国 赛 多 利 斯 公 司；型冻干机，美国 公司；型恒温振荡培养箱，江苏太仓市实验设备厂；型恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；型离心机，德国赛多利斯公司；型去离子水，德国默克公司；型高压灭菌锅，日本 公司。实验方法 候选菌株的鉴定分别对非典型沙门氏菌菌株和产气肠杆菌菌株进行生化鉴定、全自动微生物鉴定及药敏分析系统鉴定（鉴定）、分子鉴定等。首先采用海博、环凯、陆桥 家公司的沙门氏菌鉴定试剂盒对非典型沙门氏菌菌株进行生化鉴定，将产气肠杆菌接种于 肉汤管中进行生化鉴定；利用 全自动微生物鉴定系统鉴定 种菌株；按照基因组 提取试剂盒步骤提取和纯化得到非典型沙门氏菌和产气肠杆菌基因组 ，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行 测序鉴定。标准物质的制备本研究选取非典型沙门氏菌菌株 作为目标菌，选取产气肠杆菌 作为干扰菌。将沙门氏菌接种于营养肉汤培养基，、培养 。随后 离心 ，弃去上清液，菌泥用 重悬并稀释，得到适宜浓度的沙门氏菌菌液，添加干扰菌后，与冻干保护剂混匀，分装至包装瓶（沙门氏菌和产气肠杆菌均为约 瓶）。冷冻干燥得到冻干品，添加灭菌处理过的鸡肉使得净重为 ，制得鸡肉中非典型沙门氏菌标准物质。共计 瓶，置于 保存。标准物质的定量检测方法每瓶标准物质均为独立检测单元，无需再称量取样，计算时按照 计算。从 取出后在室温下放置 ，加入 无菌蒸馏水复溶，得到 稀释度的样品匀液，然后进行 倍系列稀释。选 择 个 适 宜 稀 释 度 的 样 品 匀 液，接 种方式如下：）非典型沙门氏菌计数：每个稀释度分别吸取第 卷第 期徐倩等：鸡肉中非典型沙门氏菌标准物质的研制及其在能力验证中的应用 样品匀液加入块 平板进行培养。选择有典型的沙门氏菌菌落的平板，且同一稀释度 个平板所有菌落数合计在 之间的平板，计数典型菌落数，并将菌落数量、稀释倍数和接种的样品体积通过计算得到细菌浓度，其量值单位是 。所用 培养基应满足 培养基和试剂的质量要求 中生长率大于等于 的规定。）菌落总数计数：参考 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定 。所用 培养基应满足 培养基和试剂的质量要求 中生长率大于等于 的规定。标准物质的定性检测方法参考 ，对鸡肉中非典型沙门氏菌标准物质进行定性检测。所用增菌液及培养基应符合 培养基和试剂的质量要求 的规定。标准物质均匀性和稳定性评估根据 标准物质的定值及均匀性、稳定性评估 的要求，按照随机抽样原则对标准物质的均匀性进行评估。每个水平的标准物质，随机抽取 瓶 进行定量检测，每瓶重复测量 次（见第 节标准物质的定量检测方法）。稳定性评估主要涉及标准物质在运输过程中的稳定性、客户端的贮存条件和使用有效期。将样品储存于 中，在第 、个月时间段 对样品进行稳定性评估。每次随机抽取 瓶样品进行定量检测（见第 节）。标准物质的量值鸡肉中非典型沙门氏菌标准物质的定值依据 ，选择 家经过中国合格评定国家认可委员会（）认可的实验室合作定值。每家实验室测量 瓶标准物质。测定定量标准值时，每家实验室对 瓶标准物质的沙门氏菌数量和菌落总数进行测定，每个标准物质重复测量 次，测量方法参考第 节。测定定性标准值时，每家实验室对 瓶标准物质进行检测，测量方法参考第 节。若检出沙门氏菌，为阳性；若未检出沙门氏菌，为阴性。沙门氏菌定性检测能力验证本次能力验证指定标准方法为 食品安全国家标准 食品微生物学检验沙门氏菌检验 。本研究所研制的鸡肉中非典型沙门氏菌标准物质作为考核样品 ，其含有非典型沙门氏菌及干扰菌，为沙门氏菌阳性；项目组前期研制的鸡肉中沙门氏菌标准物质命名考核样品 ，其仅含有典型沙门氏菌，为沙门氏菌阳性；项目组前期研制的鸡肉中大肠菌群计数标准物质命名考核样品 ，其不含沙门氏菌，但是含有大肠菌群，为沙门氏菌阴性。参加者共计 家，分为 组，见表 。第一组的参加者测试考核样品 两瓶、考核样品 一瓶；第二组的参加者测试考核样品 一瓶、考核样品 两瓶；第三组的参加者测试考核样品 一瓶、考核样品 一瓶、考核样品 一瓶。参加者对 瓶考核样品进行沙门氏菌定性检测，将其检测结果与考核样品（标准物质）的定性标准值进行比较，两者相同能力评价视为合格，不相同视为不合格。表 能力验证分组情况 分组参加者数量考核样品（阳性）（阳性）（阴性）第一组家瓶瓶瓶第二组家瓶瓶瓶第三组家瓶瓶瓶 实验结果 候选菌株的鉴定对非典型沙门氏菌进行生化鉴定、鉴定、分子生物学鉴定。使用环凯、陆桥、海博 家公司的沙门氏菌生化鉴定试剂套装进行生化鉴定（见表 ），结果显示为沙门氏菌阳性；使用 全自动微生物鉴定系统进行鉴定，结果显示为沙门氏菌阳性；提取非典型沙门氏菌基因组，进行 测序，结果显示核苷酸序列长度为 ，在 进行序列分析比较证明是沙门氏菌阳性。对产气肠杆菌进行生化鉴定、鉴定、分子生物学鉴定。挑取典型菌落接种于 肉汤管，培养 ，肉汤管产气，证明菌落为大肠菌群阳性。使用 全自动微生物鉴定系统进行鉴定，结果显示为产气肠杆菌阳性；提取产气肠杆菌基因组，进行 测序，结果显示核苷酸序列长度为 ，在 进行序列分析比较证明是产气肠杆菌阳性。计量学报 年 月表 非典型沙门氏菌的生化鉴定结果 生化反应项目环凯陆桥海博三糖铁琼脂产 ，斜面 紫红，底层 黄色产 ，斜面 紫红，底层 黄色靛基质（吲哚）不变色，阴性不变色，阴性不变色，阴性尿素橙黄色，阴性橙黄色，阴性橙黄色，阴性赖氨酸脱羧酶实验组绿色，对照组黄色，阳性实验组紫色，对照组黄色，阳性实验组紫色，对照组黄色，阳性氰化钾实验组不长，对照组生长，阴性实验组不长，对照组生长，阴性实验组不长，对照组生长，阴性甘露醇黄，阳性黄，阳性山梨醇黄，阳性黄，阳性 无色，阴性无色，阴性卫矛醇半固体黄色，阳性黄色，阳性丙二酸盐不变色（绿），阴性不变色（绿），阴性水杨苷蓝色，阴性 扩散，不变色 标准物质的均匀性随机抽取 瓶鸡肉中非典型沙门氏菌标准物质 进行均匀性评估，每个样品重复 次。结果表明（见表 ），使用 培养基测定沙门氏菌数量时，小于查表值 （，），其均匀性引入的相对标准不确定度根据式（）计算，非典型沙门氏菌标准值不均匀性引入的相对标准不确定度 （）。使用 培养基测定菌落总数时，小于查表值 （，），其均匀性引入的相对标准不确定度 （）。说明该标准物质在组内不存在显著性差异，其均匀性良好。槡（）式中：为瓶间标准偏差；为不均匀性引入的标准不确定度；为组间方差；为组内方差；为组内测量次数。标准物质的稳定性分别在第 、个月时间段 对样品进行稳定性评估，并记录结果，根据表 的稳定性数据进行计算可知，每个考核样品的 ，（），斜率不显著，表明这种标准物质在 下可以稳定保存 个月。因此，该标准物质建议在 的条件下储存，运输时建议使用干冰。标准物质中沙门氏菌数量的不稳定性引入的相对标准不确定度根据式（）计算，非典型沙门氏菌标准物质不稳 定 性 引 入 的 相 对 标 准 不 确 定 度 （）；菌落总数的稳定性引入的相对标准不确定度 （）。表 鸡肉中非典型沙门氏菌标准物质均匀性评估（，）（，）标准物质序号沙门氏菌数量菌落总数重复 重复 重复 重复 重复 重复 值 均匀性均匀均匀量值 （）（）（）（）（）式中：（）为不稳定性引入的相对标准不确定度；（）为斜率不确定度；为稳定性监测时间；为标准物质的标准值。标准物质定值鸡肉中非典型沙门氏菌标准物质经由 家实验第 卷第 期徐倩等：鸡肉中非典型沙门氏菌标准物质的研制及其在能力验证中的应用表 鸡肉中非典型沙门氏菌标准物质的稳定性评估 时间沙门氏菌数量菌落总数 月 月 月 月 ，（）结论稳定稳定 （）（）室合作定值。结果表明（见表 ），家实验室内部的 个 数 据 经 格 拉 布 斯（）法 和 狄 克 逊（）法检验无异常值；家实验室的平均结果经科克伦（）法检验为等精度，经 法和 法检验无异常值，经夏皮洛 威尔克法检验呈正态分布。赋值及由定值引入的相对标准不确定度包括测量重复性引入的相对标准不确定度、天平引入的相对标准不确定度、移液器引入的相对标准不确定度及稀释因子引入的相对标准不确定度。鸡肉中非典型沙门氏菌标准物质中沙门氏菌量值为 ，赋值及由定值引入的相对标准不确定度 （）；菌落总数量值为 ，赋值及由定值引入的相对标准不确定度 （）。表 鸡肉中非典型沙门氏菌标准物质的量值 编号沙门氏菌数量菌落总数沙门氏菌阳性 阴性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性等精度检验（科克伦法）等精度等精度异常值检验（法和 法）无异常无异常正态分布检验（夏皮洛 威尔克法）正态分布正态分布量值 阳性 （）（）标准物质的不确定度评定鸡肉中非典型沙门氏菌标准物质的不确定度由部分组成 ：第 部分是赋值及由定值引入的相对标准不确定度 （）；第 部分是由标准物质不均匀性引入的相对标准不确定度 （）；第 部分是标准物质不稳定性引入的不确定度 （）。将这几部分相对标准不确定度合成后计算得到标准值的合成相对不确定度 （），及扩展不确定度 （，置信概率 ）。结果显示（见表 ），标准物质中的沙门氏菌标准值为（），菌落总数标准值为（）。本研究成功研制出了鸡肉中非典型沙门氏菌标准物质。表 鸡肉中非典型沙门氏菌标准物质的不确定度 鸡肉中非典型沙门氏菌标准物质定量标准值 相对标准不确定度（）（）（）（）合成相对不确定度 （）（）扩展不确定度 （）沙门氏菌数量 菌落总数 计量学报 年 月 标准物质的沙门氏菌定性检测鸡肉中非典型沙门氏菌标准物质含有非典型沙门氏菌和干扰菌（产气肠杆菌）。样品经过 增菌后划线，在 、平板上未长出典型菌落，生化鉴定结果为沙门氏菌阴性；样品经过 增菌后划线，仅 平板有少量典型菌落，生化鉴定结果为沙门氏菌阳性。增菌和 增菌的差别与许云萧 、张亓 等观察到的现象一致。在含有沙门氏菌和杂菌的样品中，杂菌会干扰沙门氏菌的增殖，而 增菌液抑制杂菌增菌的效果相对 增菌液更好；因此，选用 增菌液能有效防止杂菌干扰鉴定结果。能力验证结果共有 家食品承检机构参加了“沙门氏菌定性检测能力验证”，家结果为全部合格，说明其在鸡肉中沙门氏菌定性检测结果准确、可靠、可比，反映出这些机构在从事相关定性检测的技术能力完备、管理水平较高。然而，有 家机构检测考核样品（鸡肉中非典型沙门氏菌标准物质）的结果不合格（不合格率为 ），未能够将含有干扰菌的阳性样品检出沙门氏菌，反应出这 家机构在鸡肉中沙门氏菌定性检测能力还需进一步提升。根据原始记录，结果不合格的实验室在划线增菌步骤中，未使用 培养基，从而将阳性结果的考核样品 误判为阴性。经过整改，不合格的实验室重新对考核样品进行检测，结果全部合格。结论本研究针对目前沙门氏菌标准物质种类缺乏、研制水平有待提高的问题，以非典型沙门氏菌为候选物进行标准物质的研制：）将产气肠杆菌作为干扰菌进行添加，并严格按照 标准物质的定值及均匀性、稳定性评估，对标准物质的沙门氏菌数量和菌落总数进行均匀性和稳定性评估；）采用多种鉴定技术对非典型沙门氏菌菌株及干扰菌进行鉴定，确保了候选菌株的可靠性；）对标准物质的定性标准值和定量标准值均进行了评定，可以满足沙门氏菌定性检测能力验证中公平公正的需求。本次能力验证中，该标准物质客观公正评价了食品承检机构的检测能力。首先，由于非典型沙门氏菌仅在 平板上有典型菌落，采用该标准物质可以针对性考核食品承检机构检测沙门氏菌出现假阴性 ，的问题。其次，该标准物质联合典型沙门氏菌标准物质（考核样品 ）及大肠菌群标准物质（考核样品 ），实现了多角度、多层次的检测能力考核。本次基于鸡肉中非典型沙门氏菌标准物质的能力验证的不合格率为 ，高于先前的沙门氏菌检测能力验证 （不合格率 ）。通过与不合格实验室沟通和整改，进一步确认其原因为未使用 培养基从而出现假阴性结果。表明该标准物质可有效评价食品承检机构的沙门氏菌检测能力。本研究制备的鸡肉中非典型沙门氏菌标准物质可以对实验室检测沙门氏菌起到预警作用，降低沙门氏菌漏检的风险，有助于提升我国食品安全监管质量。参考文献 ，（）：，：，：食品安全国家标准 食品微生物学检验沙门氏菌检验 ，（），：，（）：，（）：，（）：柴洪艳，乔璐，陈亮 奶粉中沙门氏菌检测能力验证结果与分析 首都公共卫生，（）：，（）：孙葳，赵虹，胡嵩，等 一次巧克力中沙门氏菌检验能力验证结果与分析 现代食品，（）：，（）：标准物质通用术语和定义 第 卷第 期徐倩等：鸡肉中非典型沙门氏菌标准物质的研制及其在能力验证中的应用 ，：柯璐，林杰，戴晓丽，等 肠炎沙门氏菌活菌标准物质的研制 食品研究与开发，（）：，（）：，：骆海朋，唐颂，陈怡文，等沙门氏菌能力验证样品的研制及其应用 食品安全质量检测学报，（）：，（）：标准物质定值的通用原则及统计学原理 能力验证提供者认可准则在微生物领域的应用说明 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定 隋志伟，王斌，刘思渊，等枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢测量方法研究 计量学报，（）：，（）：王斌，隋志伟，刘思渊，等基于流式分析技术的奶粉中金黄色葡萄球菌活菌快速定量检测方法研究 计量学报，（）：，（）：李龙泉，王梓权，刘思渊，等基于平板计数的类球红细菌测量方法研究 计量学报，（）：，（）：许云萧，高卫明，孙鸽云，等食品中沙门菌两种增菌液增菌效果的实验观察研究 实用医技杂志，（）：，（）：张亓，李絇 不同增菌和培养条件下沙门氏菌检出效果的比较 工业微生物，（）：，（）：朱梦，杨穗珊，林宝英 沙门氏菌检测能力验证结果分析 现代食品，（）：，（）：杜发祥，许菊霞，杜雪琴，等食品中沙门氏菌能力验证 食品安全导刊，（）：第一作者：徐倩（），湖南邵东人，湖南师范大学硕士研究生，主要研究方向为微生物计量方法。：共同第一作者：刘思渊（），山西太原人，中国计量科学研究院助理工程师，主要从事微生物计量与检测研究。：通讯作者：隋志伟（），山西太原人，中国计量科学研究院副研究员，博士，主要从事微生物计量研究。：共同通讯作者：常海艳（），河南林州人，湖南师范大学高级实验师，博士，主要从事分子病毒学研究。：计量学报 年 月