化妆品中亚硝胺总量的快速筛查与测定.pdf

分析与测评2023年8月第4期Aug.2023,No.4香料香精化妆品FLAVOUR FRAGRANCE COSMETICS100www.ffc-www.ffc-*基金项目：上海市科学技术委员会科技计划项目（编号20DZ2203 400）收稿日期：2022-06-07；修回日期：2022-06-26作 者上海市食品药品检验研究院/国家药品监督管理局化妆品监测评价重点实验室，上海 201203 简龙海 吴思霖 惠太成 韩 晶 俞 灵 郑 荣 彭兴盛化妆品中亚硝胺总量的快速筛查与测定*摘 要建立了膏霜类、水剂类、凝胶类、油剂、蜡基类化妆品中亚硝胺总量的热能分析仪快速筛查与测定方法。试样以四氢呋喃提取，提取溶液中的亚硝胺被氢溴酸脱去亚硝基，产生的 NO 用热能分析仪进行检测。结果亚硝胺（以 NNO 计）在 20 2 000 g/kg 范围内线性关系良好（r=0.999 9），方法检出限为 8 g/kg，最低定量限为 20 g/kg。方法回收率平均值为 91.4%96.8%，相对标准偏差（n=6）小于 7.5%。该方法操作简便，灵敏，可用于化妆品中亚硝胺总量的快速筛查和测定。关键词亚硝胺类 筛查 热能分析仪 化妆品 N-亚硝基化合物Rapid Screening and Determination of Total Nitrosamines in Cosmetics*JIAN Longhai WU Silin HUI Taicheng HAN Jing YU Ling ZHENG Rong PENG Xingsheng(Shanghai Institute for Food and Drug Control/NMPA Key Laboratory for Monitoring and Evaluation of Cosmetics,Shanghai 201203,China)Abstract:A method for rapid screening and determination of total nitrosamines in cream,aqueous,gel,oil and wax based cosmetics was developed by a thermal energy analyzer.The samples were extracted with tetrahydrofuran,and the nitrosamines in the extracted solution were denitrosated by hydrobromic acid.The generated NO was detected by a thermal energy analyzer.The results showed that the linear range of nitrosamines(calculated as NNO)was good in the range of 20-2 000 g/kg(r=0.999 9),the detection limit was 8 g/kg,and the limit of quantification was 20 g/kg.The average recovery was in the range of 91.4%-96.8%with the relative standard deviation(n=6)less than 7.5%.The method is simple,sensitive and can be used for the rapid screening and determination of total nitrosamines in cosmetics.Keywords:nitrosamines screening thermal energy analyzer cosmetics N-nitroso compound亚硝胺是一类具有 NNO 基团的强致癌性化合物 1，我国、欧盟等国家和地区均明确将亚硝胺列为化妆品禁用原料 1-3。化妆品原料复杂，一些胺类原料易被亚硝化 4-5，因此需要严格控制化妆品原料及其产品中的亚硝胺含量。目前我国化妆品安全技术规范（2015 年版）规定含有烷胺、烷醇胺等胺类物质的原料应避免形成亚硝胺，且产品中亚硝胺总量不得超过 50 g/kg 2。由于化妆品中胺类物质种类繁多，经亚硝化后可形成种类各异的亚硝胺 5，故有必要对化妆品中的亚硝胺总量进行测定。近几年国内外关于化妆品中亚硝胺的检测方法主要有气相色谱-质分析与测评简龙海，等作 者 简 介简龙海（1978），男，硕士，副主任药师，主要从事化妆品质量安全控制研究。联系电话：18001679632E-mail:jian_DOI:10.20099/j.issn.1000-4475.2022.0126第 4 期分析与测评简龙海，等：化妆品中亚硝胺总量的快速筛查与测定101www.ffc-谱法 6-7、液相色谱-质谱法 8-10、气相色谱-热能分析仪法 11-12等。这些方法最多仅能测定十几种已知亚硝胺的含量，无法测定其余潜在的亚硝胺含量，故不能满足亚硝胺总量检测需求。目前也鲜有见到国内关于化妆品中亚硝胺总量测定方法的报道。国外已有相关文献报道 13-16，测定原理主要为采用化学试剂（氢溴酸、氯化亚铜等）脱去亚硝胺 NNO 基团中的亚硝基（NO），或采用紫外光解法使亚硝胺中 NNO 间的化学键发生断裂，再用化学发光检测器或热能分析仪测定NO 的总量。例如 ISO/TR 14735:2013化妆品中亚硝胺测定和含量最小化用技术指导文件 13推荐 Challis 等 14建立的氢溴酸脱亚硝基法进行亚硝胺总量的筛查与测定，但该方法在分析油脂含量较高的样品时易导致提取溶液分层、测定结果重现性差等问题。Wang 等 15建立了氯化亚铜脱亚硝基法测定亚硝胺总量，但该方法不适用于含沐浴露、洗发露等易产生泡沫的化妆品。Breider等 16建立了紫外光解-化学发光法测定了洗发水中的亚硝胺总量，但未研究其它化妆品基质的测定方 法。采用氢溴酸脱亚硝基法，建立了膏霜类、水剂类、凝胶类、油剂、蜡基类化妆品中亚硝胺总量的热能分析仪法筛查方法，解决了文献报道 14-16中提取溶液分层、方法适用范围窄等问 题。1 试验部分1.1 仪器、试剂与材料800 系列脱亚硝基装置-热能分析仪，英国Ellutia 公司；MS3 型涡旋振荡器，德国 IKA 公司；5810R 型离心机，德国 Eppendorf 公司；B9500S型超声处理器，上海 Branson 公司；N-亚硝基二正丙胺标准品（批号 LRAC6182，纯度 99.95%），Sigma 公司；四氢呋喃（色谱纯），Merck 公司；氨基磺酸、乙酸乙酯、氢溴酸水溶液（质量分数 40.0%），均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；微孔滤膜（0.45 m），天津津腾公司；膏霜类、水剂类、凝胶类、油剂、蜡基类化妆品，市售。1.2 溶液制备 1.2.1 标准储备溶液精 密 称 取 N-亚 硝 基 二 正 丙 胺 标 准 品10.17 mg，置 10 mL 容量瓶中，用四氢呋喃溶解并稀释至刻度，摇匀，配制质量浓度为 1.017 mg/mL的标准储备溶液。1.2.2 标准系列溶液准确吸取 N-亚硝基二正丙胺标准储备溶液30 L，置 10 mL 量瓶中，用四氢呋喃稀释至刻度，摇匀，得 3.05 g/mL 的 N-亚硝基二正丙胺标准工作溶液（以 NNO 计，质量浓度为 1.0 g/mL）。准 确 吸 取 该 标 准 工 作 溶 液 20、50、100、200、500、1 000、2 000 L，置 10 mL 量瓶中，分别加入 0.1 g/mL 氨基磺酸水溶液 100 L，用四氢呋喃稀释至刻度，摇匀，得质量浓度分别为 2、5、10、20、50、100、200 ng/mL 的 NNO 标准溶液。1.2.3 供试品溶液精密称取试样 1.0 g，置 10 mL 具塞离心管中，加 0.1 g/mL 氨基磺酸水溶液 100 L 和四氢呋喃 2 mL，密塞，涡旋振荡 3 min 使样品充分分散，再加四氢呋喃 5 mL，涡旋振荡 1 min，超声处理20 min，取出，放至室温，加四氢呋喃至 10 mL，涡旋振荡 2 min，于 10 000 r/min 离心 5 min，取上清液，即得。1.3 试验条件试验装置如图 1 所示。反应器皿中反应液：乙酸乙酯-氢溴酸水溶液（体积比 2503）；氮气压力：5 psi（约 34.47 kPa）；氧气压力：2 psi（约13.79 kPa）；加热温度：第五档（约 85 ）；系统真空度为 1.7 Torr；冷却液：体积分数 50%乙二醇溶液；冷凝水及冷阱温度：15 ；进样体积：50 L。2 结果与讨论2.1 试验装置及测定原理本方法的仪器装置为市售产品，与 Challis等 14采用的试验装置略有差异。反应瓶较小，有图 1 试验装置示意图热能分析仪臭氧发生器冷阱进样 15 N2冷却液电热套分析与测评2023 年 8 月香料香精化妆品102www.ffc-利于形成较窄的峰形；冷凝的液体为-15 体积分数 50%乙二醇溶液，冷凝效果较 好。测定原理为：氢溴酸与亚硝胺（R2NNO，R为 H 或烃基）中的 NNO 基团发生反应，使 NNO 脱去 NO，NO 与臭氧发生反应生成激发态的*NO2，*NO2衰变发射出特征辐射，发射强度与亚硝胺的质量浓度成正比 5，反应方程式见图 2。基磺酸水溶液 28 L。在方法摸索时配制含质量分数 0.2%亚硝酸钠的化妆品样品，分别添加 0.1 g/mL氨基磺酸水溶液 0、50、100、150 L，依法测定，结果不添加氨基磺酸的样品可检出 NO，添加氨基磺酸的样品均未检出 NO。在实际样品检测中，由于化妆品成分复杂，可能存在与氨基磺酸反应的原料，故将氨基磺酸的添加量定为 100 L。若在实际样品中检出亚硝胺，可增大氨基磺酸的添加量，观察响应有无变化。若无变化，则基本表明氨基磺酸已过量。另外，考察了氨基磺酸对亚硝胺本身测定的影响。结果样品中是否添加氨基磺酸对亚硝胺本身的含量均无影响。2.2.2 提取溶剂的选择 提取溶剂应尽可能地全部溶解样品，或者可以充分溶散样品基质后溶解样品中的亚硝胺类物质。甲醇、乙腈对于蜡基类、部分膏霜类化妆品的溶散效果较差。四氢呋喃对膏霜类、水剂类、凝胶类、油剂、蜡基类化妆品均有较好地溶解、溶散能力，且对常见的 N-亚硝基二乙醇胺、N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺、N-亚硝基二丙胺、N-亚硝基二丁胺、N-亚硝基吗啉等不同理化性质的亚硝胺均有较好的溶解性。与文献 14 中的方法不同，本方法以四氢呋喃为提取溶剂，加入微量的氨基磺酸水溶液，依次提取，结果 5 种基质的提取液均无分层现象，洗发露样品无泡沫问题。因此，本方法以四氢呋喃为提取溶剂。2.3 仪器参数的优化2.3.1 氮气压力和真空度 氮气将脱亚硝基反应产生的 NO 带至检测器。若压力偏小，则峰形平缓，影响检测灵敏度；若压力偏大，则增大反应液的沸点，减弱响应。经调试，氮气压力为 5 psi 可获得较好的峰形和响应。氮气流的大小可对真空度产生影响，真空度可通过活塞阀进行调节，真空度的大小同样影响到检测灵敏度和峰形。若真空度越高，则灵敏度越高，峰形越胖。故兼顾灵敏度和峰形，选择将真空度调为 1.7 Torr。2.3.2 加热温度反应池的加热温度若偏低，则氢溴酸与亚硝胺的反应效果较差，导致检测灵敏度达不到要求；若温度偏高，则反应液蒸发速度较快，冷凝回流速度较慢，容易造成反应液蒸干的问题。经摸索，最终将加热温度调至装置的第五档（约 85 ）。图 2 亚硝胺测定反应方程式2.2 样品前处理条件的优化2.2.1 氨基磺酸的加入量文献 14-16 的方法主要为采用氢溴酸、CuCl等脱亚硝基试剂或紫外线使亚硝胺中 NNO 的化学键断裂，再用化学发光检测器或热能分析仪测定 NO 的含量，但含有 ONO、CNO、SNO 的物质同样可被氢溴酸、CuCl 或紫外线破坏后产生 NO，从而干扰亚硝胺的测定。为消除 ONO 类物质的干扰，可在样品前处理中添加适量氨基磺酸（分子式：H2NSO3H）。氨基磺酸与 ONO 类物质的反应方程式如图 3 所示，其中 RONO为有机亚硝酸酯或无机亚硝酸盐类。氨基磺酸也可显著减小 CNO 类和 SNO 类物质的干扰 15。目前在化妆品已使用原料 17中尚未见到含有 CNO、SNO 基团的化学合成类原料，但植物类原料中可能存在 CNO 类或 SNO 类物质。故建立的方法为筛查方法，若检出则需进一步研究确认结果。RONO+H2NSO3H N2+ROH+H2SO4（R=H 或烃基）图 3 亚硝酸类与氨基磺酸的反应方程式亚硝酸钠属于无机亚硝酸盐类，是化妆品安全技术规范中唯一可以作为原料添加到化妆品中的亚硝酸盐，其最大允许使用量为 0.2%（质量分数）2。按照氨基磺酸与亚硝酸钠的反应摩尔数比（11）计算，化妆品中含质量分数 0.2%亚硝酸钠时，理论上 1.0 g 样品需要加入 0.1 g/mL 氨第 4 期分析与测评简龙海，等：化妆品中亚硝胺总量的快速筛查与测定103www.ffc-2.3.3 反应液 脱亚硝基的反应液一般由乙酸乙酯（或乙酸丙酯）与氢溴酸组成。因氢溴酸一般溶解于冰醋酸或水中，故反应液中含有一定量的冰醋酸或水分，但研究表明反应液中水分含量不宜过大。与文献 12 中的方法不同，本方法中的氢溴酸水溶液质量分数 40%，故对反应液中的水分含量进行了考察。经试验，反应液中水分含量大于 10%（体积分数）时，基线噪音较大（见图 4），检测灵敏度低，信噪比不能满足检测需求；反应液中水分含量小于 3%（体积分数）时，基线噪音平稳（见图 5），信噪比可满足检测需求。结合反应瓶的大小，将反应溶液定为乙酸乙酯-氢溴酸水溶液（体积比为 2503）。不同基质测得的图谱类似，以膏霜类基质为例，空白图谱见图 7，空白基质加入 N-亚硝基二正丙胺标准溶液后测得的图谱见图 8。图 4 水分含量为 15%（体积分数）反应液的 基线噪音图谱图 5 水分含量为 1.2%（体积分数）反应液的 基线噪音图谱024135响应/V160140120100t/min图 6 N-亚硝基二正丙胺标准溶液图谱024135响应/V160140120100t/min024135响应/V160140120100t/min图 7 膏霜类空白基质图谱024135响应/V160140120100t/min图 8 膏霜类加标基质图谱024135响应/V160140120100t/min2.4 方法特异性分别取膏霜类、水剂类、凝胶类、油剂、蜡基类 5 种空白基质的化妆品，按照上述方法测定，结果空白基质均无干扰。标准品典型图谱见图 6。2.5 线性关系取标准系列溶液，按拟订的方法测定，以 NNO 的质量浓度（X，ng/mL）为横坐标，以测得的峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线。结果在2 200 ng/mL（折算到样品中，NNO 的质量浓度为 20 2 000 g/kg）范围内线性关系良好，线分析与测评2023 年 8 月香料香精化妆品104www.ffc-性方程为 Y=19.45X+7.14，相关系数 r=0.999 9。2.6 回收率试验分别称取膏霜类、水剂类、凝胶类、油剂、蜡基类 5 种不含亚硝胺的化妆品基质样品 1.0 g，每种基质称取 18 份，以 6 份为 1 组，分为 3 组。每组分别准确加入 NNO 质量浓度为 1.0 g/mL的亚硝基二正丙胺标准工作溶液各 25、100、1 500 L，涡旋混匀，制成 NNO 质量浓度分别为 25、100、1 500 g/kg 的加标样品。按拟订的方法测定，计算回收率及其相对标准偏差（RSD），结果见表 1，方法的回收率及其精密度均良好。染发剂应避免形成亚硝胺。故分别取含有上述物质的膏霜类、水剂类、凝胶类、油剂、蜡基类化妆品样品各 20 件，按照拟订的方法检测亚硝胺总量，结果水剂类、凝胶类、油剂、蜡基类样品均未检出亚硝胺。有 1 件含有染发剂的膏霜类样品检出亚硝胺，检出其质量浓度为 35 g/kg，小于化妆品安全技术规范中的限量要求（50 g/kg）。该染发膏经高效液相色谱法测定，发现含有 0.18%（质量分数）的 2-氨基-4-羟乙氨基茴香醚硫酸盐。该物质含有仲胺，可能被部分亚硝化成亚硝胺，后续将对该结果进行确认研究。3 结论建立了膏霜类、水剂类、凝胶类、油剂、蜡基类化妆品中亚硝胺总量的热能分析仪快速筛查与测定方法。方法适用范围广，操作简便，可为化妆品的质量控制、风险监测及检测标准的制订提供重要的技术参考。参考文献 陈张好,周智明,肖树雄,等.化妆品中1 N-亚硝胺类化合物的安全风险 J.中国食品药品监管,2022(1):50-56.国家食品药品监督管理总局.国家食品药品监督管理2 总局关于发布化妆品安全技术规范（2015 年版）的公告（2015 年 第 268 号）S/OL.(2015-12-23)2022-06-01.https:/ JOURNAL OF THE EUROPEAN UNION.3 Regulation(EC)No.1223/2009 of the European parliament and of the council of 30 November 2009 on cosmetic products S/OL.(2009-12-22)2022-06-01.https:/eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?qid=1579409897397&uri=CELEX:32009R1223.IKEDA K,MIGLIORESE K G,CURTIS H.Analysis of 4 nitrosamines in cosmetics J.Journal of the Society of Cosmetic Chemists,1990,41(5):283-333.杜业刚,林少彬,朱英.化妆品中亚硝胺的研究J.卫生研究,5 2004,33(3):379-380.中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准6 化管理委员会.化妆品中 N-亚硝基二甲胺等 10 种挥发性亚硝胺的测定 气相色谱-质谱/质谱法:GB/T 296692013 S.北京:中国标准出版社,2013.徐晨,陈少波.化妆品中7 N-亚硝基二甲胺和 N-亚硝基二乙胺的顶空气相色谱-质谱测定法 J.香料香精化妆品,2022(1):61-63.中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准8 化管理委员会.化妆品中 N-亚硝基二乙醇胺（NDELA）的测定 高效液相色谱-串联质谱法:GB/T 359562018 S.北表 1 5 种化妆品基质的加标回收率及 RSD(n=6)基质类型加标量/(g kg 1)平均回收率/%RSD/%膏霜类2593.87.210091.54.91 50092.63.6水剂类2591.66.910095.94.71 50094.73.5凝胶类2595.56.710093.44.61 50092.33.5油剂2594.76.810092.24.51 50096.83.2蜡基类2591.46.410096.14.21 50093.03.12.7 检出限和最低定量限取 5 种基质空白样品制备质量浓度为 10 g/kg的加标样品，依次测定。若信噪比为 3，则相应的质量浓度为检出限。若信噪比大于 3，则适当减少对照品溶液的加入量，重新测定，直至获得信噪比约为 3 的样品溶液。以 10 倍信噪比计算最低定量限。结果检出限为 8 g/kg，最低定量限为 24 g/kg。结果表明，方法的灵敏度可满足化妆品安全技术规范的检测需求。2.8 样品测定化妆品安全技术规范规定含有烷胺和烷醇胺的物质、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、部分第 4 期分析与测评简龙海，等：化妆品中亚硝胺总量的快速筛查与测定105www.ffc-京:中国标准出版社,2018.MIRALLES P,GEMERT I V,CHISVERT A,9 et al.Stir bar sorptive-dispersive microextraction mediated by magnetic nanoparticles-metal organic framework composite:determination of N-nitrosamines in cosmetic products J.Journal of Chromatography A,2019,1604:460-465.简龙海,孟茜,陈丹丹,等.液相色谱10-大气压化学离子化-串联质谱法测定化妆品中 8 种亚硝胺 J.香料香精化妆品,2015(4):59-62.邢昆明,刘华,王贻坤,等.GC-TEA 同时测定化妆品中的 511 种挥发性亚硝胺 J.安徽化工,2016,42(6):100-103,106.米文强,任风芝,刘建芬,等.热能分析仪法测定那屈肝素12 钙中 NNO 基团含量的方法学研究 J.化学与生物工程,2021,38(4):65-68.ISO(INTERNATIONAL 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模型；在酸碱中和与抑制脱氢的双重作用下，酸性体系能稳定乙酰乙酸乙酯的保存。可为电子烟调香过程中乙酰乙酸乙酯水解反应的控制及乙醇生成的溯源提供依 据。参考文献刘树文.合成香料技术手册 M.2 版.北京:中国轻工业出1 版社,2009:343.孙宝国,何坚.香料化学与工艺学 M.2 版.北京:化学工业2 出版社,2004:365-366.API A M,BELSITO D,BOTELHO D,3 et al.RIFM fragrance ingredient safety assessment,ethyl acetoacetate,CAS Registry Number 141-97-9 J.Food and Chemical Toxicology,2018,122(S1):S192-S200.陈琳.丙二酸二乙酯联产乙酰乙酸乙酯的绿色合成工艺研究4 D.上海:华东理工大学,2012.王积涛.高等有机化学 M.北京:人民教育出版社,1980:5 169-176.温光和,杨雪燕,潘红成,等.电子烟雾化液挥发性成分分析6 及开发思路探讨 J.香料香精化妆品,2016(3):6-10,17.周志强,李云淼,朱小梅.电子烟雾化液化学成分分析研究7 J.香料香精化妆品,2019(2):17-22,26.刘宇晨,蔡洁云,梁诗涵,等.电子烟的发展历史及市场态势8 J.云南化工,2021,48(8):15-17,20.邹艳,郭鹏,张博,等.顶空9-气相色谱/质谱分析水果味电子烟烟气粒相物挥发性成分 J.化学试剂,2019,41(2):168-172.费文庆.乙酰乙酸乙酯酮式与烯醇式互变平衡体系中烯醇式10 结构含量的差异分析 J.中国医药指南,2008,6(14):35-36.ZHOU L L,CHENG L,WENG X C.A novel method for 11 quantitative analysis of acetylacetone and ethyl acetoacetate by fluorine-19 nuclear magnetic spectroscopy J.Magnetic Resonance in Chemistry,2016,54(3):222-226杨海玉,李剑政,徐潇.丁二酮、乙偶姻在电子烟中的稳定12 性研究 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