环状RNA TTBK2在胶质瘤患者预后中的预测作用及功能研究.pdf

252空军航空医学2 0 2 3年0 6 月第40 卷第3期AviationMedicineofAirForce，Vo l.40，No.3，Ju n e，2 0 2 3环状RNA TTBK2在胶质瘤患者预后中的预测作用及功能研究任彬，郑晓磊，袁福摘要】目的探讨环状RNATau微管蛋白激酶2（circularRNATautubulinkinase2，c i r c-T T BK 2）在胶质瘤中的临床意义及降低circ-TTBK2后对胶质瘤增殖和侵袭的影响。方法采用实时荧光定量PCR检测正常人和胶质瘤患者脑组织和细胞系中circ-TTBK2的表达水平，生存分析采用Kaplan-Meier分析和Cox比例风险回归模型。降低circ-TTBK2并验证其干扰效率，MTT细胞增殖实验和Transwell细胞侵袭实验检测circ-TTBK2对胶质瘤细胞增殖和侵袭功能的影响。结果实时荧光定量PCR结果显示，胶质瘤组中circ-TTBK2存在过表达现象（P0.001），且WHOI-II级表达水平明显低于WHOII-IV级（P=0.003）；体外细胞实验结果提示，circ-TTBK2在U251中的表达水平明显高于正常胶质细胞株（t=3.522，P=0.0 0 1）。临床病理特征分析显示，circ-TTBK2的表达水平与WHO分级（x2=6.273，P=0.0 12）、K PS评分（x2=4.523，P=0.0 33）和肿瘤分化程度密切有关（x=11.021，P=0.0 0 1）。K a p l a n-M e i e r 曲线分析显示，在胶质瘤患者中circ-TTBK2表达水平与术后生存率密切相关（P=0.023）。Co x 比例风险回归模型分析显示，circ-TTBK2高表达、高WHO分级、低KPS评分以及肿瘤低分化程度是胶质瘤患者预后不良的危险因素（P=0.004、0.0 16、0.0 0 8、0.0 0 2）。在U251细胞中降低circ-TTBK2的表达，可抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭能力（P0.05）。结论高表达的circ-TTBK2可能是胶质瘤患者预后不良的一种新的独立指标，降低circ-TTBK2可降低胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力，提示circ-TTBK2可能作为胶质瘤的治疗靶点。关键词 circ-TTBK2；胶质瘤；预后；增殖；侵袭中图分类号 R739.41DOI;10.3969/j.issn.2097-1753.2023.03.014文献标识码 A文章编号】2 0 9 7-17 53（2 0 2 3）0 3-2 52-0 5Prognostic role and function of circRNA TTBK2 in glioma patientsREN Bin*,ZHENG Xiaolei,YUAN Fu.*Department of Emergency,The Second Afiliated Hospital of Air Force Medical University,Xian 710038,ChinaCorresponding author:YUAN Fu,E-mail:Abstract Objective To explore the clinical significance of circ-TTBK2 in glioma and the effect of circ-TTBK2knockout on the proliferation and invasion of glioma cells.Methods The expression levels of circ-TTBK2 in braintissues and cell lines of normal people and glioma patients were detected by real-time quantitative PCR.Survival wasstudied via Kaplan-Meier analysis and the Cox proportional risk regression model.circ-TTBK2 was knocked out and itsinterference efficiency was verified.The effects of CIRC-TTBK2 on the proliferation and invasion of glioma cells weretested by MTT cell proliferation assay and Transwell cell invasion assay.Results The real-time fluorescence quantitativePCR results showed that circ-TTBK2 was overexpressed in the glioma group(P0.001),and that the expression levelof WHO I-II grade was significantly lower than that of WHO II-IV grade(P=0.003).In vitro cell experiments showedthat the expression level of circ-TTBK2 in U251 was significantly higher than that in HEB(t=3.522,P=0.001).Theclinicopathological analysis of patients showed that the expression level of circ-TTBK2 was closely related to the WHOgrade(x=6.273,P=0.012),KPS scores(x=4.523,P=0.033)and tumor differentiation degrees(x2=11.021,P=0.001).Kaplan-Meier curve analysis suggested that cirC-TTBK2 expression levels in glioma patients were closely related to thepostoperative survival rate(P=0.023).Cox proportional risk regression model analysis indicated that high circ-TTBK2expressions,high WHO grades,low KPS scores and low differentiation degrees were risk factors for poor prognosis of glioma作者单位：7 10 0 38 西安，空军军医大学第二附属医院急诊科（任彬、袁福）；52 7 56 0 广东东莞，东莞市东部中心医院神经外科（郑晓磊）通信作者：袁福，E-mail：46 9 37 48 0 5 q q.c o m空军航空医学2 0 2 3年0 6 月第40 卷第3期AviationMedicineofAirForce，V o l.40，No.3，Ju n e，2 0 2 3patients(P=0.004,0.016,0.008,0.002).Knockout of circ-TTBK2 expressions in U251 cells could inhibit the proliferationand invasion of glioma cells(P0.05).Conclusion High expressions of circ-TTBK2 may be a new independent indicatorof poor prognosis in glioma patients.Knockout of circ-TTBK2 can reduce the proliferation and invasion ability of gliomacells,suggesting that circ-TTBK2 may be used as a therapeutic target for glioma.Key words Circ-TTBK2;Glioma;Prognosis;Proliferation;Invasion253胶质瘤亦被称作胶质细胞瘤，具有侵袭性强、复发率高、生存率低的特点，是最常见的高度恶性颅内肿瘤。多形性胶质母细胞瘤在所有类型胶质瘤中恶性程度最高，其中位生存期约14.6 个月2 。胶质瘤对放化疗敏感性差，通过术后辅助放射治疗、化学治疗和电场疗法等方法，仍难以控制复发，患者预后差3。因此，探索参与胶质瘤发生和发展的特定分子，并确定诊断、预后和治疗新靶点对于胶质瘤的诊疗有着重要的临床意义4。环状RNA（c i r c u l a r RNA，c i r c RNA）是一类内源性非编码RNA，在哺乳动物大脑中含量丰富且表达稳定5-6 。有研究报道，circRNA参与了肿瘤发生发展的多个阶段，其在肿瘤细胞的增殖与调亡、迁移、侵袭等过程中均有着极为重要的作用，且具有成为肿瘤诊断和预后的一种新型标志物的潜能7 。有研究发现，circRNA-002059在胃癌组织中表达呈下降趋势，且其与胃癌的恶性程度、是否发生转移以及患者的预后等方面密切相关8 ，也有研究发现，circRNA-ITCH在肝癌中表达明显下降，通过竞争性抑制作用于miR-7和miR-214，抑制Wnt/-catenin信号传导通路，且与患者预后相关9 。而对于胶质瘤，也有很多研究报道circRNA在其发生和发展过程中同样发挥了重要的作用，例如，circRNA-0014359被发现在胶质瘤细胞系中表达水平显著升高，其可通过miRNA-153/磷脂酰肌醇-3激酶通路促进胶质瘤的增殖和侵袭特性1。本研究结合临床随访数据，主要探讨环状RNATau微管蛋白激酶2（circularRNATau tubulinkinase2，c i r c-T T BK 2）在胶质瘤组织和细胞中的表达水平变化以及其对胶质瘤细胞增殖和侵袭作用，最后观察其在患者预后中的预测作用。1材料与方法1.1材料选取东莞市东部中心医院神经外科2 0 12年6 月一2 0 16 年1月行手术切除的53例胶质瘤患者，其中男30 例，女2 3例；年龄2 8 6 9 岁；WHO分级I级6例，级17 例，级2 1例，IV级9 例。对照组为颅脑外伤需要接受开颅手术的患者，共2 6 例，其中男15例，女9例；年龄2 16 3岁。取2 组患者脑组织，标本取出后即在液氮中冷冻，后转人一8 0 冰箱内。人选患者均为首次入院，经手术病理学确诊，入院前患者均未进行放、化疗治疗或其他抗癌治疗。全部53例患者出院后均随访，随访方式为电话随访和门诊随访，随访内容包括一般情况、临床症状及影像学检查。随访起点为手术日期，末次随访时间为2 0 2 1年1月，随访时间5年，至随访截止日，存活2 3例，死亡30 例，无失访病例。经我院伦理委员会通过。1.2细胞培养人胶质瘤细胞系U251或正常胶质细胞株HEB置于DMEM培养基中常规培养，设定培养箱参数为37，5%CO2。细胞常规培养7 2 h后，提取细胞上清液，4下完成离心操作。2 7 5r/min离心8 10 min，提取离心管内上清液；18 36 r/min离心15min，提取离心管内上清液；30 0 0 r/min离心30 min，用0.2 2 m滤器过滤后，24000r/min离心6 0 min。去除离心管内上清液，用1mlPBS吹打混匀管底，冻存于一8 0 冰箱。1.3MTT细胞增殖实验将处于对数生长期的细胞制成细胞悬液，调整细胞浓度。于9 6 孔板各孔中加入100u1悬液，接种密度为1.2 5万/孔，置于培养箱48 h。细胞转染后，分别在2 4、48 h和7 2 h用MTT法检测细胞活力。每孔加入50 lMTT溶液，继续在培养箱中孵育4h，然后移除培养基，并在每孔中加人二甲基亚矾。在49 0 nm波长处测量OD值，重复上述实验。1.4Transwell细胞侵袭实验基质胶准备：将冻存于-8 0 冰箱的Matrigel放至4过夜；然后将液态的Matrigel胶和无血清培养基按体积1:3充分混匀，将80lMatrigel胶稀释后均匀地铺至上室的底部，然后将2 0 0 l细胞悬液加人铺有Matrigel胶的Transwell小室的上室中；在下室加人50 0 1含有2 0%胎牛血清的DMEM高糖培养基，在37 孵育48 h后，用棉签轻轻去除未通过孔的细胞。下室细胞用4%的多聚甲醛固定细胞2 0 min，结晶紫（0.1%）染色，室温0.5h，拍照计数。1.5慢病毒感染将U251细胞接种到6 孔板中，培养24 h，然后根据说明书将携带si-circ-TTBK2的慢病毒或阴性对照（si-NC)对U251细胞进行感染。si-circ-TTBK2的序列为5-GUCAGACCAUUGAGAAAGAUU-3，阴性对照siRNA序列（si-NC）为5-CACUGACGGUGACCAG254AACAAAGAU-3。转染细胞6 h后，换成含10%FBS的无双抗培养基，继续培养48 h，以备后续实验。1.6实时荧光定量PCR检测在神经胶质瘤细胞系中验证敲低效率，使用TRIzol试剂从临床胶质瘤组织和细胞系中分离总RNA，然后进行qRT-PCR，将RNA逆转录为cDNA，随后进行PCR扩增，在9 5变性15s，6 0 退火6 0 s，在7 2 延伸10 min，重复40个循环。所用引物序列如下：circ-TTBK2上游引物正向：5-AGTGCAACATTTTCCCTGGTG-3,下游引物反向：5-GCTTGATTTTGGCTTGGCTC-3。G A PD H上游引物正向：5-ACTCCTCCACCTTTGACGC-3,下游引物反向：5-GCTGTAGCCAAATTCGTTGTC-3。采用2-Ct法进行相对定量分析，所有研究样品至少重复该实验3次。1.7观察指标比较circ-TTBK2在正常组织和胶质瘤组织，人胶质瘤细胞系U251和人正常胶质(HEB）细胞株中的相对表达量；分别利用si-circ-TTBK2和si-NC对U251细胞中的circ-TTBK2表达进行干扰，并测定这2 组中circ-TTBK2的相对表达量；分别用si-circ-TTBK2和si-NC转染U251细胞并比较U251细胞增殖情况以及侵袭性。记录卡氏行为状态(KarnofskyPerformance Status,KPS)评分：比较2组手术后1周KPS评分。KPS评分为0 10 0 分，得分越高表示健康状况越好，其中0 分表示死亡；10 分表示重危，临近死亡；2 0 分表示病重，需要住院和积极治疗；30 分表示生活严重不能自理；40 分表示生活不能自理，需要特别照顾和帮助；50 分表示常需要别人照顾；6 0 分表示生活能大部分自理，但偶尔需要别人照顾；7 0 分表示生活能自理，但不能维持正常生活和工作；8 0 分表示能勉强正常活动，有部分症状或体征；9 0 分表示能正常活动，有轻微症状、体征；10 0 分表示正常，无任何症状、体征。生存率比较：2 组均随访至2 0 2 1年1月或死亡，比较手术后5年内生存率。1.8统计学处理应用GraphPadPrism9进行数据处理和图像绘制。应用SPSS24.0软件对数据进行统计分析，circ-TTBK2在正常组织和胶质瘤组织中组间比较应用方差分析。组间患者的临床病理指标的比较采用x检验；生存率分析采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线并进行Log-Rank检验；采用单因素和多因素Cox比例风险回归模型评价影响患者预后的临床因素，主要包括年龄、性别、KPS评分、WHO分级、肿瘤大小和肿瘤分化程度，评估circ-TTBK2表达量对患者预后差异的影响。以P0.05为差异有统计学意义。空军航空医学2 0 2 3年0 6 月第40 卷第3期AviationMedicineofAirForce，Vo l.40，No.3，Ju n e，2 0 2 32.1胶质瘤组织及细胞系中的circ-TTBK2表达水平变化结果表明，与对照组相比，胶质瘤组中circ-TTBK2存在过表达现象（P0.001），且WHOI-级表达水平明显低于WHO-IV级（P=0.003），见图1A；与此同时，在体外细胞实验中的结果提示，circ-TTBK2在U251中的表达水平明显高于HEB（t=3.52 2，P=0.0 0 1），见图1B。A514-3-2-10正常组织WHOI-IIWHOI-IV注：circ-TTBK2：环状RNATau微管蛋白激酶2；HEB：正常胶质细胞株；与正常组织比较，P 0.0 5），见表1。表1circ-TTBK2表达水平与胶质瘤患者各临床病理指标的相关性circ-TTBK2表达水平（例）临床病理特征低表达（n=22）高表达（n=31)年龄50(n=27)50(n=26)性别男(n=30)女（n=23)WHO分级I-II(n=23)II-IV(n=30)肿瘤大小(cm)5(n=25)5(n=28)KPS 评分(分)80(n=20)80(n=33)肿瘤分化程度低(n=31)高(n=22)注：circ-TTBK2：环状RNATau微管蛋白激酶2；KPS：卡氏行为状态评分2.3月胶质瘤患者circ-TTBK2表达水平与术后生存率的关系阝随访期间，记录患者生存情况。然后根据2结果Bb5143-21-0121510161317914149822111411171281023724157HEB文值P值0.1950.6590.0950.7586.2730.0120.1210.7284.5230.03311.0210.001U251空军航空医学2 0 2 3年0 6 月第40 卷第3期AviationMedicineofAirForce，Vo l.40，No.3，Ju n e，2 0 2 3Kaplan-Meier法分析circ-TTBK2表达水平与患者预后的关系见图2。结果显示，circ-TTBK2高表达组术后生存率显著低于低表达组（P=0.023）。10080-(%）60-40-200注：circ-TTBK2：环状RNATau微管蛋白激酶2；不同表达水平比较，P=0.023图2 circ-TTBK2高表达组和低表达组脑胶质患者生存率的比较2.4circ-TTBK2的表达与胶质瘤临床病理指标的单因素和多因素Cox比例风险回归模型为了进一步探索影响胶质瘤患者预后的独立因素，采用单因素和多因素Cox比例风险回归模型进行分析。结果如表2 所示，circ-TTBK2高表达、高WHO分级、低KPS评分和肿瘤低分化程度是胶质瘤患者预后不良的危险因素（P=0.004、0.016、0.0 0 8,0.0 0 2)。2.5siRNA千扰效率验证利用siRNA对U251细胞中的circ-TTBK2表达进行干扰，抑制其表达，分别于感染后2 4、48 h提取细胞总RNA，进行检测。实时荧光定量PCR检测结果显示，相较于si-NC组细胞中的表达量，circ-TTBK2在si-circ-TTBK2组的相对表达量下降，且差异有统计学意义（P0.001），提示转染成功，见图3。1.51.00.50si-circ-TTBK2组注：circ-TTBK2：环状RNATau微管蛋白激酶2，与si-NC组比较，P0.001图3circ-TTBK2在细胞中表达情况2.6降低circ-TTBK2后抑制胶质瘤细胞增殖能力为了进一步研究circ-TTBK2在胶质瘤中的作用，本研究进行单因素分析临床病理特征HR(95%CI)年龄（50 岁vs50岁）1.278(0.8622.354)性别(男vS女）1.408(0.696 2.417)WHO分级（II-IV级vsI-II级）2.409(1.3724.500)肿瘤大小(5cm vs5cm)1.753(1.0133.053)KPS 评分(8 0 vs 80)2.706(1.4605.071)肿瘤分化程度（低vs高）3.311(1.815 6.314)circ-TTBK2表达（高vs低）3.005(1.5995.680)注：circ-TTBK2：环状RNATau微管蛋白激酶2；KPS：卡氏行为状态评分255了体外实验。分别用si-circ-TTBK2和si-NC转染U251细胞，在转染后2 4、48、7 2 h采用MTT法检测circ-TTBK2对细胞增殖的影响，结果显示，与si-NC组相比，si-circ-TTBK2组U251细胞的增殖能力减弱，见图4。1.57(ao)来1.0-1020术后时间（个月）circ-TTBK2低表达水平一circ-TTBK2高表达水平asi-NC组表2 胶质瘤患者临床病理特征和circ-TTBK2表达的单因素和多因素Cox回归性分析HR(95%CI)0.5170.6020.0180.3500.0120.0050.007一Si-NCsi-circ-TTBK2b3040b50600.5-0注：circ-TTBK2：环状RNATau微管蛋白激酶2；与同一时刻si-NC组比较，P0.05,p0.01图4不同时间点U251细胞的增殖情况2.7降低circ-TTBK2后抑制胶质瘤细胞侵袭能力通过Transwell实验验证其对U251细胞侵袭能力的影响。结果发现，与si-NC组相比，si-circ-TTBK2组U251细胞的侵袭性明显受到抑制，见图5。200110050si-NCsi-circ-TTBK2注：circ-TTBK2：环状RNATau微管蛋白激酶2；A：细胞侵袭实验图（结晶紫染色，10 0）；B：侵袭细胞数量，与si-NC比较，“P0.001图52 组U251细胞的侵袭能力3讨论circRNA是一种结构稳定的且广泛表达的新型RNA，在生物体中含量丰富，可通过多种形式调控下游基因表达，具有广泛的临床应用潜力 。越来越多的证据证实，circRNA在多种肿瘤的发生、发展和转移等病理过程中发挥了重要作用12 。如circRNA-MYLK可作为miR-29a的竞争内源性RNA（c e RNA），通过激活VEGFA/VEGFR2和下游Ras/ERK信号通路，促进EMT和膀胱癌的发展13。circRNA在肿瘤的预后中也有着至P值24细胞培养时间(h)多因素分析2.524(1.4034.718)2.974(1.6645.395)3.562(1.9436.572)3.287(1.9576.107)4872P值0.0160.0080.0020.004256空军航空医学2 0 2 3年0 6 月第40 卷第3期AviationMedicineofAirForce，V o l.40，No.3，Ju n e，2 0 2 3关重要的作用，其通过调节胶质瘤细胞周期、调亡、侵袭和迁移，影响患者预后。有研究报道，与正常脑组织相比，胶质瘤患者的has-circ-0037251表达水平显著上调且WHO分期、KPS评分与has-circ-003725的表达水平相关4。由于circRNA稳定性较高、易被检测，应用于临床可为胶质瘤的诊疗提供新的线索及理论依据5。故circRNA具有广泛的临床应用潜力，相信对circRNA的不断深入研究能使人类对恶性肿瘤的成因及发展产生更深的了解以期提高胶质瘤的诊疗水平，延长患者的生存期,减少复发和放化疗抵抗。本研究选取了与胶质瘤相关的circ-TTBK2，探究其在胶质瘤中的表达水平变化及在其患者预后中的预测作用。本研究结果显示，circ-TTBK2在胶质瘤组织和细胞系中的表达增高，且WHOI-级表达水平低于WHO-I V级；此外，circ-TTBK2在U251中的表达水平明显高于HEB。该结果表明，circ-TTBK2的高表达可能与胶质瘤的恶性程度相关，提示其可能在胶质瘤的发展中发挥重要作用。鉴于此，进一步验证了circ-TTBK2在胶质瘤组织中的表达与临床病理特征的关系。本研究结果提示circ-TTBK2高表达水平与WHO分级、KPS评分和分化程度相关，而与年龄、性别、肿瘤大小无关，其结果证实了circ-TTBK2表达水平与恶性程度相关，进一步推测其与患者病死率也具有相关性。随后，Kaplan-Meier曲线分析显示，与circ-TTBK2低表达组相比，circ-TTBK2高表达患者术后生存率显著低于低表达患者，提示circ-TTBK2高表达与患者预后密切相关，其可能是胶质瘤患者预后的预测因子。Cox比例风险回归模型分析显示，circ-TTBK2高表达、高WHO分级、低KPS评分和低分化程度是胶质瘤患者预后不良的危险因素，进一步提示circ-TTBK2可能作为胶质瘤的独立预后标志物。此外，为了深人研究circ-TTBK2在胶质瘤发生发展中具体的作用机制和其生物学效应，本研究进行了降低circ-TTBK2的处理，用si-circ-TTBK2和si-NC转染U251细胞，通过实时荧光定量PCR验证了circ-TTBK2在Si-TTBK2组中的表达水平明显低于阴性对照组。随后，通过MTT细胞增殖实验和Transwell细胞侵袭证实了降低circ-TTBK2显著抑制了细胞增殖和侵袭，这提示circ-TTBK2有潜力作为胶质瘤的治疗靶点。综上所述，circ-TTBK2在胶质瘤组织和细胞系中的表达明显增高，circ-TTBK2高表达可能是胶质瘤患者预后不良的一种新的独立指标，降低circ-TTBK2可降低胶质瘤细胞的增殖和侵袭。因此，circ-TTBK2有望作为胶质瘤的新的治疗靶点。【参考文献】1 Wang LM,Shao LW,Cheng B,et al.Chordoid glioma:a clinicopathological studyJj.Zhonghua bing li xue za zhi,2021,50(8):865-869.2Stupp R,Hegi M E,Mason W P,et al.Effects of radiotherapywith concomitant 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