鸡传染性喉气管炎疫苗研究进展.pdf

鸡传染性喉气管炎疫苗研究进展徐少珠，张国丽，丘成文，邝贞结，吴燕华，卢丽平，齐冬梅*（广东永顺生物制药股份有限公司，广东 广州 511356）摘 要：鸡传染性喉气管炎（Infectious Laryngotracheitis，ILT）是由喉气管炎病毒（InfectiousLaryngotracheitis Virus，ILTV）引起的鸡的一种病毒性呼吸道传染病。ILT是一种较为严重的禽病毒病；根据ILT的临床表现分为急性型和温和型，急性型发病率和死亡率均较高，温和型死亡率低但在养殖密集地区感染逐渐增多。ILT可引起家禽死亡和蛋鸡产蛋率下降，给养禽业带来严重的经济损失。目前，通过使用疫苗接种和生物安全相结合的综合防控措施，在集约化养禽地区ILT已得到较好的控制。该文对多个国家已商品化的ILT减毒活疫苗和重组病毒载体活疫苗，以及正在研发中的ILT重组病毒载体活疫苗、基因缺失活疫苗、病毒样颗粒疫苗等新型ILT疫苗进行综述，以期为更好地防控ILT提供理论参考。关键词：鸡传染性喉气管炎；减毒活疫苗；灭活疫苗；重组载体活疫苗；基因缺失活疫苗；病毒样颗粒疫苗中图分类号：S852.5文献标识码：A文章编码：10058567（2023）04003507Research Progress of Infectious Laryngotracheitis VaccinesXU Shaozhu，ZHANG Guoli，QIU Chengwen，KUANG Zhenjie，WU Yanhua，LU Liping，QI Dongmei*（Guangdong Winsun BioPhamaceutical Co.，Ltd，Guangzhou Guangdong 511356）Abstract：Infectious Laryngotracheitis（ILT）is a viral respiratory infection of chickens caused by the InfectiousLaryngotracheitis Virus（ILTV）.ILT is still a serious avian virus disease to susceptible chickens，especially in theintensive poultry farming areas.ILT is clinically manifested as acute type and mild type，the acute type has highmorbidity and mortality，while the mild type has low mortality but increasing infection in intensive poultry farmingareas.ILT can cause death and decreased egg production，and lead to severe economic to the poultry industry.Atpresent，ILT has been well controlled in intensive poultry farming areas through comprehensive prevention and controlmeasures combining vaccination and biosafety.In this paper，we reviewed the commercialized attenuated live ILTvaccines and recombinant virus vector live vaccines in many countries，as well as the new ILT vaccines underdevelopment，such as recombinant virus vector live vaccines，genedeletion live vaccines and viruslike particlevaccines,in order to provide references for better prevention and control of ILT.Keywords：Infectious Laryngotracheitis；live attenuated vaccine；Live recombinant viral vector vaccine；Inactivated vaccine；Genedeletion live vaccines；Viruslike particle vaccine收稿日期：20221105作者简介：徐少珠（1971年生），女，兽医师，研究方向：兽用生物制品。Email：*通讯作者：齐冬梅（1974年生），女，博士，研究员，研究方向：兽用生物制品。Email：Guangdong Journal of Animal And Veterinary ScienceDOI:10.19978/ki.xmsy.2023.04.07广东畜牧兽医科技广东畜牧兽医科技2023年（第48卷）第4期专题综述鸡传染性喉气管炎（InfectiousLaryngotracheitis，ILT）是 由 喉 气 管 炎 病 毒（Infectious Laryngotracheitis Virus，ILTV）引起的鸡的一种病毒性呼吸道传染病。根据ILT的临床表 35专题综述鸡传染性喉气管炎疫苗研究进展徐少珠，等现可分为急性型和慢性型。急性型ILT可引起以呼吸困难、气喘、咳出带血粘液、中度至重度结膜炎、眼睑肿胀、流涕增多、产蛋量下降等，发病率可达100%，死亡率为5%70%1。慢性型也称温和型，临床症状多以结膜炎、鼻窦炎、眼鼻分泌物、眼窦肿胀、消瘦、产蛋率下降等为特征，死亡率较低。ILTV 为疱疹病毒科、疱疹病毒亚科、传染性喉气管炎病毒属病毒，病毒颗粒呈球形，核衣壳为二十面体对称，核衣壳外周包裹着不规则的囊膜，囊膜表面有纤突。基因组为 155 kb 的双链线性DNA。编码多个 ILTV 的囊膜糖蛋白，如 gB、gC、gG、gJ、gL和gM等，这些糖蛋白不但在病毒侵入和复制过程中起着至关重要的作用，同时也是良好的免疫原性蛋白，能够刺激机体产生体液免疫和细胞免疫12。1925年ILT在美国首次被报道，目前在世界上大多数国家都有报道，ILT是影响家禽业的重要病毒性疾病之一，可导致严重的经济损失1，3。ILT主要采取生物安全和疫苗接种相结合的防控策略。正在使用的ILT疫苗种类主要有减毒活疫苗，重组病毒载体活疫苗和灭活苗等，正在研发中的疫苗有重组病毒载体活疫苗、基因缺失活疫苗、病毒样颗粒疫苗等。1ILT减毒活疫苗ILT 减毒活疫苗分为鸡胚源（Chicken embryoorigin，CEO）和组织细胞源（Tissue culture origin，TCO）两类。可通过滴鼻、点眼、饮水和喷雾等多种方式免疫接种，可诱导良好的免疫力，在世界各地广泛使用，为ILT的疫情防控做出了巨大的贡献。上世纪50年代末和60年代，第一代商用ILTCEO减毒活疫苗Hudson株和Cover株在美国获准生产和临床使用，Hudson株和Cover株均由强毒经鸡胚连续传代致弱获得。气管内接种Cover株疫苗的鸡可抵御强毒攻击4。Hudson株可通过点眼、滴鼻和气管内接种等多个途径免疫。Hudson 株和Cover株疫苗目前仍然在北美、西欧、东欧、东南亚和东北亚、中东、俄罗斯、巴基斯坦和南非等多个国家和地区使用5。1964年，Gimeno等将ILTV强毒通过鸡胚肾细胞或肝细胞连续传代100多代次后获得第一个TCO ILT减毒疫苗株ASL L6。研究表明，TCO疫苗通过滴鼻和点眼方式免疫接种，可为免疫禽提供免疫保护4。1969年，CEO Samberg疫苗株由分离于以色列的一株ILTV强毒经在鸡胚绒毛膜尿囊膜上连续传代致弱获得，Samberg株可通过点眼和气管内接种免疫6。1966年，CEO SA2疫苗株由澳大利亚ILTV强毒分离株经鸡胚连续传代致弱获得。1983年，CEO SA2疫苗株在鸡胚细胞连续传代培养后获得A20疫苗株。SA2和A20株疫苗限定只在澳大利亚使用7。Serva疫苗株是由墨西哥分离株经鸡胚传代致弱获得的减毒株。我国首个CEO减毒活苗鸡传染性喉气管炎活疫苗（K317 株）由广东永顺生物制药股份有限公司（原广东省生物药品厂）研制开发，1991年获得中国农业部新兽药批准注册 新兽药证书号为：（1991）新兽药证字26号。现由国内多个厂家生产并在我国广泛使用。其他源自不同国家和地区的ILTV强毒株经鸡胚或鸡源细胞致弱的减毒活疫苗有：Salsbury#146株、Connecticut株、LTIVAX株、CHP50株、CE株等2。正在或曾在我国注册的ILT减毒活疫苗很多，有些毒株如 Samberg 株毒力较强，有些毒株如Hudson株和CE株等毒力太弱免疫效力差等原因不予注册2。目前在我国注册的ILT减毒活疫苗具体见下表1所示。表1我国注册的ILT减毒活疫苗新兽药名称鸡传染性喉气管炎活疫苗（K317株）鸡传染性喉气管炎耐热保护剂活疫苗鸡传染性喉气管炎活疫苗（Serva株）鸡传染性喉气管炎活疫苗鸡传染性喉气管炎活疫苗（LTIVAX株）鸡传染性喉气管炎活疫苗（CHP50株）研发单位/生产企业广东永顺生物制药股份有限公司瑞普（保定）生物药业有限公司英特威国际有限公司印度尼西亚美迪安有限公司英特威国际有限公司西班牙海博莱生物大药厂新兽药注册证书号（1991）新兽药证字26号（2009）新兽药证字04号（2021）外兽药证字70号（2021）外兽药证字69号（2021）外兽药证字04号（2018）外兽药证字7号注：数据来源于中国兽药信息网，国家兽药基础数据库（查询时间：2023年03月22日）。36鸡传染性喉气管炎疫苗研究进展徐少珠，等专题综述表2我国注册的重组ILT载体活疫苗新兽药名称鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒二联活疫苗研发单位/生产企业中国农业科学院哈尔滨兽医研究所诗华美国动物保健公司新兽药注册证书号（2005）新兽药证字6号（2019）外兽药证字19号注：数据来源于中国兽药信息网，国家兽药基础数据库（查询时间：2023年03月22日）。2ILT重组载体活疫苗鸡痘病毒（Fowl pox virus，FPV）、火鸡疱疹病毒（Herpesvirus of Turkeys，HVT）、新 城 疫 病 毒（Newcastle disease virus，NDV）、ILTV 等是重组载体活疫苗常用的病毒载体，重组病毒载体可插入多个抗原基因，实现构建多价或多联多价疫苗的目的89。FPV、HVT、NDV常用于表达ILTV保护性抗原基因的重组载体活疫苗的研制和开发，重组 HVT（rHVT）、重 组 FPV（rFPV）、重 组 NDV（rNDV）疫苗表型稳定，无毒力返强和水平传播的风险，使用便捷，可以胚内或1日龄雏禽皮下接种10 11。目前，国内外已有多个 rHVTILT 和rFPV ILT活疫苗获得批准上市，并在世界范围内广泛使用。另外，ILTV本身也是一个非常有效且常用的表达其它病原保护性抗原的病毒载体，并已成功应用于多个疫病的疫苗开发。2.1ILT重组鸡痘病毒活疫苗（rFPVILT）2005年中国农业科学院哈尔滨兽医研究所童光志研究团队以FPV为病毒载体表达ILTV WG株gB基因，构建了rFPVILTVgB疫苗株。重组病毒能在体内稳定表达外源 gB 基因，刺激机体产生抗ILTV gB蛋白的抗体以及细胞介导的免疫。免疫鸡可以抵御强毒 ILTV WG 株和 FPV 102 株的攻击。此疫苗安全性好、免疫效力优良，免疫持续期为5个月。rFPVILTVgB株作为我国首个rFPV ILT活疫苗，即鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗获得中国农业部新兽药批准注册 新兽药证书号为：（2005）新兽药证字6号。这是目前在我国广泛使用的ILT疫苗之一12。诗华美国动物保健公司（以下简称：诗华美国）生产的鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒二联活疫苗（VectormuneFPLT），是分别将ILTV NS175株和632株的UL32基因和gB基因、大肠杆菌lacZ标记基因同时插入FPV病毒载体，构建的rFPV ILT二联活疫苗。诗华美国生产的另一个ILT载体活疫 苗 是 重 组 ILT+禽 脑 脊 髓 炎（Avianencephalomyelitis，AE）鸡 痘 载 体 活 疫 苗（VectormuneFPLT+AE），是将ILTV gB、UL32基因和AE的保护性抗原基因同时引入FPV病毒载体，构建的重组三联FPV载体活疫苗。该疫苗株可在鸡胚成纤维细胞中繁殖，能够稳定表达ILTV蛋白。8周龄及以上鸡通过鸡翅翼膜刺种，可对ILTV提供免疫保护13。Sun 等构建了表达 NDV F 蛋白、HN 基因和ILTV gB基因的rFPV疫苗株，并利用4周龄SPF鸡进行免疫攻毒试验；结果显示，rFPV对NDV强毒攻击提供一定的保护力，对ILTV强毒攻击可达到与ILT减毒活疫苗相同的效果。rFPV株可能是一种通过单次免疫可以同时预防NDV和ILTV的候选疫苗14。他蕾利用两株不同的FPV为病毒载体，构建了表达不同长度ILTV gB基因的6个rFPVILT疫苗株，其中表达全长gB基因的两株rFPV疫苗株均获得100%的保护率15。许霄对rFPVILTV gB株进行效力检检，初次免疫后50天进行第二次免疫，二免后 28 天用 ILTV 119 株和 FPV 102 株强毒攻击，保护率均为100%。rFPVILTV gB株对SPF鸡和商品蛋鸡均安全有效，可以作为防控ILT和FP的二联候选疫苗16。目前在我国注册的重组ILT载体活疫苗均为rFPVILT活疫苗，具体详见表2。2.2ILT重组火鸡疱疹病毒活疫苗（rHVTILT）诗华美国生产的表达ILTV gB基因的HVT载体活疫苗为 VectormuneLT（即 HVTLT）。HVT/LT的体外生长动力学与亲本毒HVT FC126株相似。超剂量安全检验结果显示，HVTLT对18日龄SPF鸡胚胚内接种和1日龄SPF雏鸡皮下注射接种均安全。疫苗株在SPF鸡上连续传5代未返强，混合饲养的免疫鸡和非免疫鸡不会发生水平传播。皮下接种免疫1日龄SPF鸡，免疫7周后对强毒攻击获得92%100%的保护率。对商品肉鸡18日龄鸡胚胚内免疫，孵化后在21日龄和35日龄进行强 37毒攻击，其保护率分别为67%和87%，攻毒对照鸡的发病率分别为100%和73%17。英特威国际有限公司研发和生产的同时表达了 ILTV gD 蛋白和 gI 蛋白的 HVT 载体活疫苗为Innovax ILT（即rHVTLT gI/gD）。Maekawa等选择商品肉鸡胚内免疫接种rHVTLT gI/gD疫苗，并在孵化后28日龄时攻毒，ILT临床症状显著下降，攻毒期间免疫鸡体重未下降，气管内强毒病毒载量减少65%18。Vagnozzi等胚内接种或1日龄肉鸡皮下接种rHVTLT gI/gD疫苗，57日龄肉鸡攻毒结果显示，气管内病毒载量减少了5倍，但免疫鸡可将攻毒强毒水平传播给未免疫鸡19。Vagnozzi 等对 rHVTILT（Innovax ILT，英特威/先 灵 葆 雅 动 物 保 健 公 司）、rFPV ILT（VectormuneFPLT，诗华美国）病毒载体疫苗、CEO减毒活疫苗（LTIVAX株，英特威/先灵葆雅动物保健公司）进行保护效果的比较研究；无论胚内或皮下免疫接种，在攻毒保护和降低气管中病毒载量上rHVTILT 疫苗均比rFPVILT 疫苗表现更佳19。rFPVILT疫苗皮下注射比胚内接种方式效果更好，但不能减少攻毒后气管中的病毒载量。两种重组疫苗的免疫产生期明显长于CEO减毒活疫苗。点眼免疫CEO ILT减毒活疫苗组获得最佳免疫保护19。Gimeno 等 将 鸡 立 克 病 毒（Marek s diseasevirus，MDV）超强毒Md5株meq致癌基因特异性删除，改造为 BACMEQ 病毒载体，并制备了携带ILTV gB基因的BACMEQdkddkdk；此疫苗株可抵御ILTV强毒攻击，与rHVTILT商品苗保护效果一致。同时对 MDV 超强毒 648A 株也提供完全保护。BACMEQgB株可能是利用超强毒MDV为病毒载体开发ILT重组疫苗的新方法20。2.3ILT 重组新城疫病毒载体活疫苗（rNDVILT）Zhao等以NDV LaSota株为病毒载体，制备了表达ILTV gB和gD蛋白的rNDV rLS/ILTVgB株和rLS/ILTVgD株。体外培养稳定性良好，病毒滴度和生长动力学与亲本毒一致。免疫SPF鸡，可同时对ILTV和NDV提供免疫保护，抵御ILTV和NDV强毒的攻击。rLS/ILTVgB株免疫商品肉鸡效果与减毒活疫苗相同。可以通过喷雾或饮水进行鸡群大规模免疫接种21。Yu等选择了NDV母源抗体HI平均滴度为6.4 log2、ILTV中和抗体阳性的商品肉鸡进行了免疫攻毒试验，以评估母源抗体对LS/ILTVgB株和rLS/ILTVgD株的免疫效力的影响，试验结果表明，即使存在NDV和ILTV母源抗体，对LS/ILTVgB株和rLS/ILTVgD株的免疫效力无显著影响22。Yu等将rLS/ILTVgD株在鸡胚中连续传8代，重组病毒保持了其生长动力学、低致病性和gD基因表达水平不变，遗传稳定性良好23。由以上结果可知，rLS/ILTVgB株和rLS/ILTV gD株是安全、有效的防控ND和ILT二联候选疫苗2123。Basavarajappa 等制备了分别表达ILTV gB、gC和gD蛋白的rNDVILT疫苗株：rNDVgB、rNDVgC和rNDVgD株，各疫苗株单独免疫或组合免疫的试验结果表明，rNDVgD株免疫的雏鸡对ILTV强毒攻击提供完全保护；rNDVgB、rNDVgC株单独或与其它rNDV组合的多价苗免疫组对ILTV强毒攻击只提供部分保护或不保护，因此rNDVgD株可能是一种安全有效的防控 ND 和 ILT 的二联疫苗24。贺言以NDV耐热毒株TS09C株为病毒载体表达ILTV gB基因，构建了rTSgB疫苗株，该毒株与亲本毒生物学特性相同，免疫攻毒效果与商品弱毒苗相当均为100%保护，未免疫对照组全部发病且有死亡，因此rTSgB株可作为防控ILT和ND的二联候选疫苗25。2.4以ILTV为载体的重组载体活疫苗ILTV作为疱疹病毒科的成员，也是一个有效且应用广泛的病毒载体，并已成功的应用于多个疫病特别是禽病毒病疫苗开发。Lschow等将禽流感病毒（Avian Influenza virus，AIV）H5N2亚型分离株的 HA 基因引入 ILTV 强毒株 A489 株的非必需UL50基因位点，获得HA基因稳定表达的ILTV UL50HAa和 ILTV UL50HAb株，免疫鸡产生了ILTV和AIV H5N2特异性抗体，并可对ILTV和两种不同的AIV强毒攻击提供保护26。Veits等将ILTV A489株改造为UL0基因缺失的ILTV UL0病毒载体，将AIV H7亚型HA基因和GFP标签基因插入到ILTV UL0株的UL0基因位点，构建稳定表达外源蛋白的 ILTV UL0G株，ILTV UL0G株免疫鸡可为ILTV和 AIV H7专题综述鸡传染性喉气管炎疫苗研究进展徐少珠，等 38亚型强毒攻击提供保护，因此ILTV UL0G株有可能成为预防 AI H7 亚型和 ILT 的二联候选疫苗27。3ILT基因缺失活疫苗为了获得更稳定的ILT减毒活疫苗，减少活疫苗毒力返强的可能性，科研工作者广泛地开展了ILT基因缺失活疫苗的研究。Veits等以ILTV A489株为病毒载体，构建了ILTV UL0基因缺失株ILTVUL0株，缺失株在体内毒力减弱，但能够抵御ILTV强毒攻击28。Devlin等利用ILTV强毒CSW1株构建了gG缺失的gGILTV株，SPF鸡毒力和免疫原性试验结果表明，gGILTV 株比SA2株和A20 株毒力低；免疫鸡可抵御 ILTV 强毒的攻击2829。gGILTV 株可通过饮水和点眼进行免疫，其诱导的保护水平与气管内接种效果相同30。Garca等利用ILTV强毒株USDAch株，构建了ORF C基因缺失的DORF C株在鸡肾细胞中生长动力学和病毒效价与亲本毒一致；气管内或点眼接种DORF C株的鸡，显微镜下观察到的气管损伤比亲本毒低，使用DORF C株点眼免疫的鸡获得与TCO减毒活疫苗相当的免疫保护31。以上试验结果显示，ILTV UL0株、gGILTV株和DORF C 株均为有潜力的 ILT 基因缺失活疫苗。4ILT灭活疫苗4.1油乳剂灭活疫苗Honda等证实ILT的免疫机制主要是细胞介导的免疫，细胞免疫在对抗ILTV感染中起到非常重要的作用32。多个试验结果也证实ILT灭活疫苗免疫鸡，灭活抗原可以诱导抗 ILTV 的特异性抗体，但单独使用灭活抗原并不能提供足够的保护3335。PalominoTapia等对单独接种或组合接种ILTCEO或TCO活疫苗、重组病毒载体疫苗（rHVTILT或 rFPVILT）和 ILT 油乳剂灭活疫苗（KILLED）的35周和74周龄蛋鸡进行攻毒以评价免疫效力35。试验结果表明：仅接种了灭活疫苗组，免疫禽的血清抗体滴度很高，但不能提供免疫保护，验证了细胞免疫在预防 ILTV 感染的重要性。TCO+rHVTILT+KILLED组和rHVTILT+KILLED组，在35周鸡攻毒结果中获得最佳的免疫效果，且免疫持续期更长。在74周攻毒时临床症状和攻毒后5天气管内病毒载量均减少，获得更好的免疫保护，各项试验指标均优于单疫苗接种组35。因此，在一些禁止使用ILT CEO减毒活疫苗的南美洲国家，饲养期比较长的鸡通常采用ILT油乳剂灭活疫苗与TCO减毒活疫苗或重组活疫苗等联合使用的免疫策略。4.2病毒样颗粒疫苗病毒样颗粒（Viruslike Particles，VLPs）疫苗具有不包含任何遗传物质，不能体内复制，不具传染性；同时VLPs抗原近似病毒、结构高度重叠对称能够有效激活B细胞等优点，因此也被应用到ILT疫苗的研制和开发。Schdler等将ILTV gB蛋白或gG蛋白展示在鼠白血病病毒（Murine leukaemia virus，MLV）的VLPs上，制备了ILT VLPgG和VLPgB疫苗。该VLPs疫苗对杂交蛋鸡具有良好的耐受性，可通过胚内或皮下注射免疫。胚内免疫接种VLPgG疫苗可诱导机体产生抗体反应，而VLPgB组的几乎检测不到细胞免疫反应。由于VLPs疫苗应用无明显的副作用，而且被证明可以引起基于抗体的免疫反应，ILT VLPs有可能成为新的安全有效疫苗选择36。5总结与展望ILT是鸡的一种重要的呼吸道疾病，每年给世界各地的家禽业造成重大经济损失。从1958年的第一个CEO源ILT减毒活疫苗到2000年第一个ILT重组病毒载体活疫苗获批使用，这些疫苗世界范围内的广泛使用，为ILT的防控做出了非常重要的贡献。ILT减毒活疫苗具有免疫原性良好，可诱导机体产生良好的免疫力、生产工艺技术简单且成本低等优点。但基于ILTV的病毒特征，临床使用过程中还存在以下几个缺点：活毒存在隐性感染、毒力返强和水平传播的风险；疫苗株的毒力与免疫效力之间存在相关性，毒力强免疫效果好的毒株副反应大，毒力太弱的毒株免疫效力差。ILT重组病毒载体活疫苗无潜伏感染、无毒力返强和水平传播的风险，但起效慢、免疫效力与ILT减毒活疫苗相比还有待提高等15，19，37。世界范围内禽类产品需求不断增加，同时家鸡传染性喉气管炎疫苗研究进展徐少珠，等专题综述 39禽养殖高度集约化，家禽业持续的面临着各类疫病的严峻挑战。疫苗接种仍然是目前ILT防控最重要的措施之一。为了更好的开发和研制高效的ILT疫苗产品、探索潜在新型候选疫苗，应做好ILT的流行病学调研，掌握ILTV的流行动态；利用不断发展的生物技术，更深入的认知ILTV，如基因组和蛋白、病毒毒力决定因素和影响因子、抗原/抗体和宿主之间的关系等；更精准的靶向病原体保守抗原表位和中和抗体产生表位进行疫苗设计，以研制更安全高效、成本可控的疫苗产品。参考文献：1 GOWTHAMAN V，KUMAR S，KOUL M，et al.Infectiouslaryngotracheitis：Etiology，epidemiology，pathobiology，andadvances in diagnosis and control a comprehensive reviewJ.Veterinary Quarterly，2020，40（1）：140161.2 夏业才，陈光华，丁家波.兽医生物制品学 M.北京：中国农业出版社，2018.3 蒋露.鸡传染性喉气管炎病毒致病性评价及 2 株分离株基因组序列分析 D.北京：中国农业科学院，2015.4 GARCIA M，ZAVALA G.Current and future vaccines andvaccination strategies 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