黄柏盐炙前后对肾阴虚大鼠肠道菌群的影响.pdf

实验研究 基金项目:国家自然科学青年基金(.)辽宁省自然科学基金面上项目(.)沈阳市中青年科技创新人才项目(.)作者简介:赵佳慧女硕士生研究方向:中药炮制学:.通信作者:张凡男博士副教授研究方向:中药炮制学:.黄柏盐炙前后对肾阴虚大鼠肠道菌群的影响赵佳慧葛修通任文静周悦张凡(.辽宁中医药大学药学院辽宁 大连.辽宁省中药炮制工程技术研究中心辽宁 大连)摘要:目的 比较黄柏及其盐炙品对肾阴虚模型大鼠肠道菌群多样性的影响 方法 将 只大鼠随机分成 组分为空白组、模型组、阳性组、生黄柏高剂量组、生黄柏低剂量组、盐黄柏高剂量组和盐黄柏低剂量组采用先给药后灌胃给予氢化可的松建立肾阴虚模型 采用 法分析大鼠血液中相应指标确认模型建立 测序分析各组大鼠肠道菌群的差异 结果除空白组其余各组/比值明显升高肾阴虚模型建立成功 与空白组相比模型组大鼠有明显的肾阴虚症状 肾阴虚模型组大鼠肠道菌群结构与空白组差异明显盐黄柏能改善不同分类水平上肠道菌群的相对丰度优于生黄柏并接近空白组 结论盐黄柏调节肾阴虚大鼠肠道菌群的效果更好关键词:黄柏盐炙肾阴虚肠道菌群中图分类号:.文献标志码:文章编号:():./.(.):()()().()./.:黄 柏 是 芸 香 科 植 物 黄 皮 树(.)的干燥树皮味苦性寒归肾、膀药学研究 .胱经 黄柏具有清热燥湿、泻火解毒、除骨蒸的功效临床多用于湿热泻痢、湿热黄疸 黄柏经过盐炙后增强滋阴降火、退虚火的作用 肾阴是一身阴气之本是肾中物质基础的体现部分有滋润、濡养全身脏腑的作用 肾阴虚大多由于久病等因素导致肾中阴液亏虚虚火内生所导致的病症肠道菌群及其代谢物在维持肠道微生态环境中发挥重要作用并与多种疾病的发生密切相关 本文采用 高通量测序方法分析黄柏盐炙前后对肾阴虚大鼠肠道菌群多样性的影响并筛选丰度具有显著差异的菌群 并从肠道菌群角度探讨黄柏盐炙后滋肾阴效果的增强以解析黄柏盐炙的炮制原理 材料.动物 成年健康雄性 大鼠 只体重()购自辽宁长生生物技术股份有限公司提供合格证号为(辽)本研究的所有程序均按照辽宁中医药大学附属医院动物伦理委员会(许可证号:)批准的方案进行.试药黄柏购自四川雅安经鉴定为芸香科植物黄皮树(.)的干燥树皮食盐(大连盐化集团有限公司)六味地黄丸(兰州太宝制药有限公司)纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)氢化可的松注射液(天津金耀药业有限公司)大鼠、酶联免疫分析试剂盒均购自上海科兴有限公司(产品批号:、)测序仪(美国型号:)生物安全柜()实验方法.黄柏及盐黄柏制备.生黄柏制备取黄柏原药材除去杂质喷淋清水润透切丝干燥得生黄柏.黄柏盐炙品制备 取净黄柏丝用盐水拌匀(每 黄柏丝用食盐 )闷润 待盐水被吸尽后置炒制容器内用文火加热至 时炒 取出晾凉得黄柏盐炙品.供试品的制备 分别称取适量黄柏生品、黄柏盐炙品饮片加 倍量水浸泡 煎煮 过滤药液在药渣中再加入 倍量水煎煮 过滤合并两次滤液浓缩至适宜浓度黄柏生品和黄柏盐炙品低、高剂量组给药浓度分别为.、.取六味地黄丸作为阳性药适量研磨成细粉加入适量水溶液溶解至浓度为.给药组大鼠的给药量为 /.动物分组及给药造模将 只 级雄性大鼠随机分为 组即空白对照组、模型对照组、阳性对照组、黄柏生品低剂量组、黄柏生品高剂量组、黄柏盐炙品低剂量组、黄柏盐炙品高剂量组每组 只大鼠每天灌胃给药 次空白对照组、模型对照组给予相同剂量的生理盐水各组连续给药 灌胃给药的第 天开始除空白对照组外其他组灌胃氢化可的松造模氢化可的松浓度为 模型组大鼠的给药量为 /空白对照组给予相同剂量的生理盐水连续灌胃 .大鼠体重测定给药期间(前 )每 称量 次大鼠体重造模期间()每天称量 次大鼠体重并做好记录.大鼠粪便样品的采集最后 次造模给药 后采用提尾刺激法刺激大鼠排出粪便将粪便放入无菌的 管中立即放入液氮中迅速冻存保存在 冰箱中 用于肠道菌群多样性的分析.大鼠胸腺形态大鼠麻醉后迅速取出胸腺组织用预冷的生理盐水清洗 遍滤纸吸干水分.大鼠肾脏指数大鼠麻醉后迅速取出肾脏组织用预冷的生理盐水清洗 遍滤纸吸干水分使用万分之一天平称量各自重量根据下面公式计算肾脏脏器指数脏器指数脏器重量()/体重().高通量测序技术检测大鼠肠道菌群.提取和 扩增根据 提取试剂盒提取粪便中的总 使用 的琼脂糖凝胶电泳检测 的提取质量使用 测定 浓度和纯度 对 基因 可变区进行 扩增.测序 将同一样本的 产物混合后使用 琼脂糖凝胶回收 产物利用 进行回收产物纯化 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 并 用 对回收产物进行检测定量 使用 进行建库首先进行链接接头再使用磁珠进行筛选利用 扩增的方法进行文库模板的富集最后使用磁珠回收 产物得到文库 利用 公司的 平台进行测序药学研究 .数据处理 使用 软件对原始测序序列进行质控使用 软件进行拼接:过滤 尾部质量值 以下的碱基根据 之间的 关系将成对 拼接()成一条序列并筛选不符合序列调整序列方向 使用 软件根据相似度对序列进行 聚类并剔除嵌合体 利用 对每条序列进行物种分类注释比对 数据库 实验结果.肾阴虚模型大鼠建立结果 与空白组相比模型组 含量明显增加(.)与模型组相比各给药组 含量明显降低盐黄柏高剂量组 含量最低其次阳性组(.)与空白组相比模型组 含量明显降低(.)与模型组相比各给药组 含量均增加其中生黄柏高剂量组含量显著性升高(.)与空白组相比模型组/比值明显升高(.)与模型组相比各给药组/比值均降低盐黄柏高、低剂量组/比值明显降低(.)结果见图 图 各组大鼠血清中、含量及/比值图 注:与空白组相比.与模型组相比.大鼠体重变化结果空白组大鼠 内体重平稳增长其余各组前 体重平稳增长造模给予氢化可的松的第 天(即第 天)开始体重明显降低模型组大鼠体重降低趋势最为显著盐黄柏高剂量组大鼠体重降低趋势最小结果见图.大鼠胸腺形态结果空白组大鼠胸腺形态完整组织肥厚颜色偏淡模型组大鼠胸腺萎缩不成形布满红点颜色偏红其余各给药组大鼠胸腺形态均有明显改变其中盐黄柏高剂量组大鼠胸腺形态优于其他给药组大鼠胸腺形态图 各组大鼠体重变化趋势图.肾脏指数结果 与空白组相比模型组大鼠肾脏指数显著性增加(.)与模型组相比各给药组肾脏指数均降低阳性组大鼠肾脏指数显著性降低(.)盐黄柏高剂量组大鼠肾脏指数明显降低(.)生黄柏高、低剂量组大鼠肾脏指数也有所降低但无统计学差异结果见图 图 各组大鼠肾脏脏器指数图 注:与空白组相比.与模型组相比.肠道菌群多样性结果.组间物种 分析通过分析样本物种组成并绘制稀释曲线图发现样本 左右时曲线逐渐趋于平坦说明测序数据量合理样本量增加只会产生少量的新物种基于样本不同测序深度并选取 图作为多样性指数的 数绘制曲线可知样本在 左右时曲线逐渐趋于平坦说明测序数据量足够大能够反映样本中绝大多数微生物多样性信息(见图)聚类分析为物种组成分析的一部分以便进一步分析肠道菌群的组成 根据 图(见图)能够直观地看出 组样本中物种的重叠情况及其相似性并统计出其共有及特有的 数目 基药学研究 .图 样本物种组成分析图于各组肠道菌群样本空白组特有 个模型组特有 个阳性组特有 个盐黄柏高剂量组特有 个生黄柏高剂量组特有 个五组共有 个图 在不同处理组分布的 图.组间物种 多样性分析主坐标分析()见图结果发现 和 对总体方差解释的百分比分别为.和.空白组与肾阴虚模型组大鼠菌群完全分开与空白组比较肾阴虚模型组大鼠菌群结构具有明显差异各给药组样本距离空白组更近盐炙品高剂量组距离空白组更近几乎重叠其次是阳性药组和生黄柏高剂量组二者几乎重叠 黄柏及其盐炙品能够明显改善肾阴虚大鼠肠道菌群的结构盐黄柏效果明显优于生黄柏图 各组大鼠肠道菌群的 得分分布.肠道菌群结构的门、科水平分析门水平下不同组别大鼠肠道菌群的组成情况见图 厚壁菌门()相对丰度最高拟杆菌门()和放线菌门()相对丰度次之与空白组相比肾阴虚模型组 相对丰度明显减少(.)、相对丰度增加(.)与模型组相比各给药组 均明显升高(.)盐黄柏组相对丰度均高于生黄柏组同种饮片下低剂量组效果优于高剂量组各给药组中 明显降低(.)盐黄柏组中 低于生黄柏组盐黄柏低剂量组 相对丰度最低各给药组中 明显降低(.)盐黄柏高剂量组 相对丰度最低科水平下不同组别大鼠肠道菌群的组成情况见图 乳酸菌科()相对丰度最高其次是 科()、毛螺菌科()、肠球菌科()、丹毒丝菌科()与空白组相比模型组、相对丰度明显降低(.)相对丰度明显增加(.)与模型组相比各给药组 相对丰度明显增加(.)生黄柏低剂量组丰度增加最为明显各给药组 明 显 增 加(.)盐 黄 柏 低 剂 量 组 增加最为明显各给药组 显著增加(.)盐黄柏高剂量组 相对丰度远远高于其他给药组.差异菌群筛选 应用 软件根据分类学原理对不同组别进行线性判别分析并找出对样本药学研究 .划分产生显著性差异影响的群落或物种 分析在门、纲、目、科、属分类水平上具有显著性差异的菌群如图 判别柱形图(见图)统计多组中有显著差异的微生物类群通过 分析(线性回归分析)获得的 分值该分值越大代表物种丰度对差异效果影响越大并以此进行分析将各组别的优势菌群按照 分值由大到小的顺序进行排列得到以下结果与空白组相比肾阴虚模型组大鼠粪便中杆菌纲()、梭菌目()、梭菌科()、梭菌属()、异杆菌属()等显著高于空白组与模型组相比生黄柏组中消化链球菌目()、颤螺菌目()、瘤胃球菌科()、消化链球菌科()、罗斯氏菌属()为优势菌群 与模型组相比盐黄柏组中厚壁菌门()、乳酸杆菌目()、肠球菌科()、肠球菌属()为优势菌群 模型组中的优势菌群在生黄柏组和盐黄柏组丰度明显降低 为空白组 为模型组 为阳性对照组 为黄柏生品低剂量组 为黄柏生品高剂量组 为黄柏盐炙品低剂量组 为黄柏盐炙品高剂量组图 门水平上不同组别的菌群组成 为空白组 为模型组 为阳性对照组 为黄柏生品低剂量组 为黄柏生品高剂量组 为黄柏盐炙品低剂量组 为黄柏盐炙品高剂量组图 科水平上不同组别的菌群组成药学研究 .为空白组 为模型组 为阳性对照组 为黄柏生品低剂量组 为黄柏生品高剂量组 为黄柏盐炙品低剂量组 为黄柏盐炙品高剂量组图 分析黄柏及其盐炙品对肾阴虚大鼠肠道菌群的影响 讨论本研究采用糖皮质激素类药物(氢化可的松)建立肾上腺皮质功能亢进型肾阴虚大鼠模型空白组大鼠体重平稳增长毛发柔顺精神状态良好肾阴虚大鼠外观表征发生改变体重明显降低毛发失华扎堆拱背精神萎靡各给药组大鼠肾阴虚症状明显得到改善 胸腺是人体重要的免疫器官大剂量氢化可的松损伤机体器官抑制机体的免疫功能模型组胸腺形态的明显改变提示其对机体免疫系统损伤尤为迅速各给药组大鼠胸腺形态有所改善肾阴虚模型大鼠肾脏指数明显升高给药组大鼠肾脏指数均降低盐黄柏组作用效果优于生黄柏组 肠道菌群包括一系列复杂的微生物并占有一定的比例能够维持肠道内微生物的生态平衡其组成变化对人体健康有一定的影响研究证明肠道菌群与多种疾病均有密切联系 图(见图)可以看出肾阴虚大鼠肠道菌群组成与正常大鼠明显不同肾阴虚由肾中阴液亏虚导致在临床上其主要病症表现为糖尿病 中医认为糖尿病属于消渴病由阴虚燥热引起黄柏具有明显的降糖作用 研究发现糖尿病患者 的比例明显下降 的比例明显上升 结合在门、纲、目、科、属分类水平上的差异菌群筛选的结果与健康大鼠相比黄柏及其盐炙品在门水平上能够上调 比例下调 的比例盐炙品效果更佳 丰度降低是肠道内微生物失调的重要特征之一大多有益菌属于 其中 能够维持肠道内微生态环境稳定在科水平上与模型组相比盐黄柏组中、相对丰度均有明显差异 是肠道内的有益菌群能够维持肠道内微生物环境稳态盐黄柏通过增加 相对丰度改善肠道菌群微生态环境 能发酵代谢葡萄糖产生甲酸、乙酸和丙酸等短链脂肪酸并加快毒素的排泄还能代谢色氨酸其代谢产物能够保护肠道上皮屏障盐黄柏组 相对丰度明显增加黄柏盐炙品有缓解肠道炎症保护肠道的潜力 的聚集物质能够促进损伤上皮细胞和内皮细胞的黏附并促进肠内转运和糖化蛋白体外实验中能够增强肾小管上皮细胞的黏附 和 为盐黄柏组的优势菌群可能与其聚集物质增强肾小管上皮细胞的黏附有关近年来肠道菌群已被证实与多种疾病的发生都有密切联系实验结果表明肾阴虚模型大鼠肠道菌群与正常大鼠肠道菌群相比在不同水平下物种组成及相对丰度都具有明显差异大剂量氢化可的松改变肠道微生态增加有害菌群定殖减少有益菌群增殖黄柏盐炙前后均能调节肾阴虚大鼠肠道内药学研究 .为空白组 为模型组 为阳性对照组 为黄柏生品低剂量组 为黄柏生品高剂量组 为黄柏盐炙品低剂量组 为黄柏盐炙品高剂量组图 判别柱形图菌群的相对丰度进而改善肠道微生态环境且黄柏盐炙后调节肾阴虚大鼠肠道菌群的效果更好参考文献:李勇张诗雯李丽等.黄柏及盐炙品对肾阴虚大鼠神经内分泌免疫作用的影响研究.辽宁中医杂志():.贾天柱.中药炮制学.上海:上海科学技术出版社.():.陈茜薛勇宋晓峰等.糖尿病及糖尿病心血管并发症患者肠道菌群的特征.微生物学报():.():.王梓宇张智慧吴鹏等.基于肠道菌群和短链脂肪酸代谢探讨甘草制远志降低肠道炎症的作用机制.中草药():.白晓晔孙志宏张和平.益生乳酸菌与肠道菌群稳态.食品与生物技术学报():.():.():.():.(收稿日期:)药学研究 .