黄芪总皂苷对肺腺癌细胞增殖、迁移、凋亡能力及HIF-1α_VEGF信号通路蛋白表达的影响.pdf

山东医药2023 年第 63 卷第 23 期黄芪总皂苷对肺腺癌细胞增殖、迁移、凋亡能力及HIF-1/VEGF信号通路蛋白表达的影响陈静，田伟平，韦小白上海市静安区中心医院肿瘤科，上海200040摘要：目的探讨黄芪总皂苷对肺腺癌细胞增殖、迁移、凋亡能力的影响及其机制是否与缺氧诱导因子 1（HIF-1）/血管内皮生长因子（VEGF）信号通路有关。方法将肺腺癌A549细胞分为黄芪总皂苷高、中、低剂量组和对照组，分别加入浓度为200、100、50 mol/L的黄芪总皂苷和等体积的二甲基亚砜（DMSO），培养24 h。采用CCK-8法检测细胞增殖能力，细胞划痕实验检测细胞迁移能力，流式细胞术检测细胞凋亡率，Western blotting法检测HIF-1、VEGF及表皮生长因子受体（EGFR）蛋白表达。结果黄芪总皂苷高、中、低剂量组和对照组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率依次降低，细胞迁移距离依次升高，组间两两比较P均0.05。黄芪总皂苷高、中、低剂量组和对照组细胞HIF-1、VEGF及EGFR蛋白相对表达量均依次升高，组间两两比较P均0.05。结论黄芪总皂苷可降低肺腺癌细胞的增殖、迁移能力，并诱导其凋亡，且随浓度升高而更明显，其机制可能与抑制HIF-1/VEGF信号通路有关。关键词：黄芪总皂苷；肺腺癌细胞；细胞增殖；细胞迁移；细胞凋亡；缺氧诱导因子1；血管内皮生长因子；表皮生长因子受体doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.23.003 中图分类号：R734.2 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2023）23-0011-04Effects of total astragalosides on proliferation，migration，apoptosis and HIF-1/VEGF signaling pathway protein expression of lung adenocarcinoma cellsCHEN Jing，TIAN Weiping，WEI XiaobaiDepartment of Oncology，Jingan District Central Hospital，Shanghai 200040，ChinaAbstract：Objective To investigate the effects of total astragalosides on the proliferation，migration and apoptosis of lung adenocarcinoma cells and whether the mechanism is related to the hypoxia-inducing factor 1（HIF-1）/vascular endothelial growth factor（VEGF）signaling pathway.Methods Lung adenocarcinoma A549 cells were divided into the high-dose，medium-dose and low-dose total astragalosides groups and control group，which were added with 200，100 and 50 mol/L total astragalosides and equal volume of dimethyl sulfoxide（DMSO），respectively，and were cultured for 24 h.Cell proliferation capacity was determined by CCK-8 assay，cell migration capacity was determined by scratch assay，apoptosis rate was determined by flow cytometry，and the expression levels of HIF-1，VEGF and epidermal growth factor receptor（EGFR）protein were determined by Western blotting.Results The inhibition rates of cell proliferation and apoptosis rates in the high-dose，medium-dose and low-dose total astragalosides groups and control group decreased successively，while the cell migration distance increased successively，with statistically significant differences between groups（all P0.05）.The relative expression levels of HIF-1，VEGF and EGFR protein in the high-dose，medium-dose and low-dose total astragalosides groups and control group increased successively，with statistically significant differences between groups（all P0.05）.Conclusion Total astragalosides can reduce the proliferation and migration of lung adenocarcinoma cells，and induce their apoptosis，which is more significant with the increase of concentration，and its mechanism may be related to the inhibition of HIF-1/VEGF signaling pathway.Key words：total astragalosides；lung adenocarcinoma cells；cell proliferation；cell invasion；apoptosis；hypoxia-inducible factor-1；vascular endothelial growth factor；epidermal growth factor receptor基金项目：国家自然科学基金资助项目（81903860）。第一作者简介：陈静（1993-），女，住院医师，主要研究方向为呼吸系统及消化系统肿瘤中西医结合治疗。E-mail：通信作者简介：韦小白（1981-），女，主治医师，主要研究方向为呼吸系统中西医结合防治肿瘤的临床及基础。E-mail：开放科学（资源服务）标识码（OSID）11山东医药2023 年第 63 卷第 23 期肺癌是全球肿瘤相关死亡的主要原因，由于其临床症状不明显，75%的患者确诊时已处于中晚期，丧失了手术治疗最佳时机1。在过去的30年里，由于肺癌的高复发率及高侵袭性，导致患者的5年生存率仍只有 18%2。随着近年来中医药研发工程的兴起，临床研究者逐渐将重点放在中药方面。研究表明，中药可减轻化学药物的毒性，增强放化疗敏感性，减少肿瘤复发和转移3。黄芪总皂苷具有抗癌、抗氧化、免疫调节等作用，而含有黄芪药物的一些中药复方在改善肿瘤患者的生活质量、减轻化疗药物的血液学毒性及肝功能损害等方面均具有重要作用4。炎症是肿瘤发生的原因之一，巨噬细胞极化是进入炎症微环境的切入点，黄芪总皂苷可通过阻断肺癌相关巨噬细胞的M2极化，从而抑制肺癌细胞生长、侵袭、迁移和血管生成能力5。除了诱导免疫细胞极化，黄芪总皂苷是否还可以通过其他途径发挥作用，目前仍不是十分清楚。2021年10月2022年10月，本研究观察了黄芪总皂苷对肺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响，并探究其相关分子机制是否与缺氧诱导因子 1（HIF-1）/血管内皮生长因子（VEGF）信号通路有关，为黄芪总皂苷在肺癌治疗中的应用提供依据。现报告如下。1 材料与方法 1.1材料细胞：人肺腺癌细胞株A549购自上海酶研生物科技有限公司。药物：黄芪总皂苷购自上海一飞生物科技有限公司，纯度99.1%。主要试剂：RPMI1640 培养基和胰蛋白酶均购自美国 Gibco 公司，DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司，标准胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，CCK-8试剂购自上海碧云天生物技术有限公司，表皮生长因子受体（EGFR）、VEGF 抗体均购自英国Abcam公司，HIF-1抗体购自美国CST公司，辣根过氧酶标记的二抗购自北京中杉金桥科技有限公司。1.2细胞分组处理将肺腺癌A549细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 g/mL 链霉素的 RPMI1640 培养基中，置于 37、5%CO2培养箱中孵育，待细胞长满培养瓶80%时用胰蛋白酶消化、计数、传代。将肺腺癌A549细胞分为黄芪总皂苷高、中、低剂量组和对照组，分别加入浓度为200、100、50 mol/L的黄芪总皂苷和等体积的二甲基亚砜（DMSO）。1.3细胞增殖能力观察采用CCK-8法。取对数生长期的肺腺癌A549细胞，以1105/mL接种于96孔板，设3个复孔，参照“1.2”进行分组处理。各组培养 24 h，每孔加入 CCK-8 溶液 10 L，继续培养2 h。使用酶标仪测定450 nm处的吸光度（A）值，计算 细 胞 增 殖 抑 制 率。细 胞 增 殖 抑 制 率（%）=（A对照孔A实验）/A对照孔100%。1.4细胞迁移能力观察采用细胞划痕实验。使用马克笔在6孔板的背面均匀作一平行直线，每孔5条。每孔加入各组分组处理后培养24 h的细胞悬液2 mL（包含约5105个细胞），待细胞铺满孔底后，用枪头作一垂直于马克笔横线的划痕，PBS漂洗后加入细胞培养基，显微镜下拍照，记为0 h划痕宽度。将培养板置于37 的CO2培养箱中，继续培养24 h，显微镜下拍照，记为24 h划痕宽度。计算各组细胞迁移距离，细胞迁移距离=0 h划痕宽度24 h划痕宽度。1.5细胞凋亡能力观察采用流式细胞术。取各组分组处理后培养 24 h 的细胞，用不含 EDTA 的0.25%胰酶消化，1 200 r/min离心5 min，去上清，加PBS重悬。用PBS将细胞冲洗2次，1 200 r/min离心5 min，去上清。上流式细胞仪检测细胞凋亡率，严格参照AnnexinV-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作。1.6细胞HIF-1、VEGF及EGFR蛋白检测采用Western blotting法。取各组分组处理后培养96 h的细胞，PBS 冲洗后加入细胞裂解液，冰浴 20 min，12 000 r/min 离心 15 min，取上清液，采用 Bradford法测定蛋白含量。100 变性10 min，每孔加等量蛋白样品进行 12%SDS-PAGE 凝胶电泳，电转移至PVDF 膜 上，5%牛 奶 室 温 封 闭 1 h。分 别 加 入HIF-1、VEGF、EGFR 及内参 GAPDH 一抗（稀释比例分别为 1 1 000、1 1 000、1 1 000 及 1 10 000），4 孵育过夜。TBST漂洗5 min3次，加入二抗（稀释 比 例 为 11 000），室 温 孵 育 1 h，TBST 洗 涤10 min3次。ECL室温反应 5 min后曝光，Syngene凝胶成像仪扫描。采用GeneSnap光密度软件分析条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。1.7统计学方法采用SPSS23.0统计软件。计量资料采用K-S正态性检验，呈正态分布时以-x s表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布时以M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验。P0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1各组细胞增殖抑制率、细胞迁移距离及细胞凋亡率比较黄芪总皂苷高、中、低剂量组和对照组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率依次降低，细胞迁移距离12山东医药2023 年第 63 卷第 23 期依次升高，组间两两比较P均0.05。见表1及OSID码图1。2.2各组细胞HIF-1、VEGF及EGFR蛋白相对表达量比较黄芪总皂苷高、中、低剂量组和对照组细胞 HIF-1、VEGF 及 EGFR 蛋白相对表达量均依次升高，组间两两比较P均0.05。见表2及图1。3 讨论 黄芪总皂苷是从中草药黄芪中纯化而来，其性质甘甜温和，参与肺和脾的经络调节，具有调理脾胃、补血益气、防治风寒等功效，对增强人体免疫功能具有显著疗效。同时，黄芪总皂苷也可通过调节各种免疫信号传导通路蛋白和因子，参与抗炎和保护神经细胞活性等过程6-7。研究显示，黄芪总皂苷可通过调节mTOR信号通路的传导，抑制相关编码基因表达，进而降低肿瘤细胞VEGF蛋白表达，抑制肿瘤组织新生血管生成和肿瘤远处转移8。本研究结果显示，黄芪总皂苷对肺腺癌A549细胞增殖具有明显抑制作用，随着黄芪总皂苷药物浓度的升高，其增殖抑制作用和促凋亡能力增强；经过不同浓度黄芪总皂苷处理过的肺癌细胞迁移能力降低，随着黄芪总皂苷药物浓度的升高，其迁移能力逐渐降低；这提示黄芪总皂苷可降低肺腺癌细胞的增殖、迁移能力，并诱导其凋亡，且浓度越高效果越明显。这与既往研究证实黄芪总皂苷能够抑制人乳腺癌细胞增殖和侵袭能力9的结论一致。转移是肿瘤相关死亡的主要原因，而新生血管生成是肿瘤转移的潜在机制之一。血管是介导远端转移的重要结构，参与加速肿瘤生长、维持肿瘤微环境、提供生长和侵袭信号、促进肿瘤转移等多种过程，并可引起肿瘤相关的全身性疾病10。HIF-1是细胞缺氧时形成的缺氧诱导因子，在肿瘤血管新生过程中处于重要地位，当细胞外环境出现缺氧或细胞代谢率过高导致相对缺氧时，可以激活组织及细胞大量表达HIF-111。HIF-1的活性水平与肿瘤发生、血管生成和转移相关。同时，HIF-1位于多种致癌和抑癌途径的交汇点，包括 PI3K/AKT 和MAPK/ERK信号通路，而这些信号通路是分子信号网络的核心，控制着许多细胞的生长、增殖、分化和生存，而肿瘤组织常高表达HIF-112-13。VEGF是一类结构和功能相关的蛋白分子，其靶基因VEGF-A在转录水平上主要受HIF-1的调控，可通过促进血管内皮细胞增殖而促进肿瘤血管生成14。EGFR信号蛋白作为HIF-1/VEGF信号通路的上游调控因子，参与了肿瘤血管生成。研究表明，在EGFR突变的非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中，可以以缺氧独立的方式上调HIF-1，从而诱导VEGF表达，而当EGFR信号通路被抑制时VEGF下调，这提示EGFR的激活可能驱动VEGF表达15。HIF-1/VEGF是肿瘤血管生成的重要信号通路，EGFR信号蛋白参与了该信号通路的传导及调节。本研究结果显示，黄芪总皂苷干预后肺腺癌 A549 细胞 HIF-1、VEGF 和EGFR蛋白表达均降低，提示黄芪总皂苷对肺腺癌A549 细胞发挥抗肿瘤作用可能是通过使 HIF-1/VEGF信号通路失活来实现的。综上所述，黄芪总皂苷可降低肺腺癌细胞的增殖、迁移能力，并诱导其凋亡，其机制可能与抑制HIF-1/VEGF信号通路有关。至于黄芪总皂苷调表1各组细胞增殖抑制率、细胞迁移距离及细胞凋亡率比较（-x s）组别黄芪总皂苷高剂量组黄芪总皂苷中剂量组黄芪总皂苷低剂量组对照组细胞增殖抑制率（%）68.74 3.18*#49.16 4.43*#26.32 5.94*9.34 5.38细胞迁移距离（m）0.298 0.015*#0.461 0.027*#0.618 0.034*0.773 0.042细胞凋亡率（%）39.62 2.23*#28.12 0.74*#11.05 0.12*4.02 0.13注：与对照组比较，*P0.05；与黄芪总皂苷低剂量组比较，#P0.05；与黄芪总皂苷中剂量组比较，P0.05。表2各组细胞HIF-1、VEGF及EGFR蛋白相对表达量 比较（-x s）组别黄芪总皂苷高剂量组黄芪总皂苷中剂量组黄芪总皂苷低剂量组对照组HIF-10.19 0.85*#0.27 0.08*#0.37 0.18*0.46 0.34VEGF0.23 0.19*#0.39 0.34*#0.51 0.24*0.61 0.12EGFR0.48 0.42*#0.64 0.59*#0.72 0.31*0.83 0.23注：与对照组比较，*P0.05；与黄芪总皂苷低剂量组比较，#P0.05；与黄芪总皂苷中剂量组比较，P0.05。A B C DVEGFHIF-1 EGFRGAPDH注：A为对照组、B为黄芪总皂苷低剂量组、C为黄芪总皂苷中剂量组、D为黄芪总皂苷高剂量组。图1各组细胞VEGF、HIF-1、EGFR蛋白表达条带图 （Westen blotting法）13山东医药2023 年第 63 卷第 23 期控肿瘤细胞生物学行为的过程中是否有其他作用机制尚未可知，需进一步实验证实。参考文献：1SUNG H，FERLAY J，SIEGEL RL，et al.Global cancer statistics 2020：GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries J.CA Cancer J Clin，2021，71（3）：209-249.2DANGELO A，SOBHANI N，CHAPMAN R，et al.Focus on ROS1-positive non-small cell lung cancer（NSCLC）：crizotinib，resistance mechanisms and the newer generation of targeted therapies J.Cancers（Basel），2020，12（11）：3293.3WANG S，LONG S，WU W.Application of traditional chinese medicines as personalized therapy in human cancersJ.Am J Chin Med，2018，46（5）：953-970.4SUN S，LIU L，SONG H，et al.Pharmacokinetic study on the co-administration of abemaciclib and astragaloside IV in ratsJ.Pharm Biol，2022，60（1）：1944-1948.5XU F，CUI W Q，WEI Y，et al.Astragaloside inhibits lung cancer 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