黄连素与口服益生菌制剂联用对腹泻型肠易激综合征的作用.pdf

收稿日期：2022-08-29作者简介：李少洁，硕士，主管药师；高分飞，通信作者，博士，教授，E-mail：汕头大学医学院学报Journal of Shantou University Medical College第36卷 第2期2023年6月Vol.36 No.2June 2023黄连素与口服益生菌制剂联用对腹泻型肠易激综合征的作用李少洁1，李闻钰2，高分飞3（1汕头大学医学院第一附属医院全科医学分院，广东汕头515041；2纽迪希亚制药有限公司，上海200020；3汕头大学医学院药理学教研室，广东汕头515041）摘要 目的：探讨黄连素与口服益生菌制剂联用对腹泻型肠易激综合征（diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，IBS-D）的干预效果，为临床上两药联用的可能性提供实验依据。方法：建立番泻叶灌胃联合束缚刺激诱导的IBS-D小鼠模型，单独或联合给予黄连素、口服益生菌制剂治疗后，以体重变化率、Bristol粪便性状评分、腹壁撤退反射评分、结肠组织病理学变化以及肠道菌群变化为指标，评价药物的干预效果。结果：黄连素单用及联合口服益生菌制剂均能降低Bristol粪便性状评分和腹壁撤退反射评分（P0.05），而单用口服益生菌制剂在恢复IBS-D小鼠体重增长方面有一定的优势（P0.05）。结肠组织病理切片观察显示，用药后均能减轻结肠的炎症范围。肠道菌群定量分析结果显示，黄连素与口服益生菌制剂联用能提高双歧杆菌属和乳杆菌属的相对含量（P0.05），降低大肠杆菌的相对含量（P0.05）。结论：黄连素与口服益生菌制剂联用未显示出拮抗作用，在改善肠道菌群失调上具有一定的增强作用。关键词 肠易激综合征；腹泻；黄连素；口服益生菌制剂中图分类号 R574.62文献标志码 A文章编号 1007-4716(2023)02-0065-06DOI：10.13401/ki.jsumc.2023.02.001Effect of berberine combined with oral probiotic formulations ondiarrhea-predominant irritable bowel syndromeLI Shaojie1,LI Wenyu2,GAO Fenfei3(1.Family Medicine Centre,the First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College,Shantou 515041,China;2.NutriciaPharmaceutical Co.,Ltd,Shanghai 200020,China;3.Department of Pharmacology,Shantou University Medical College,Shantou515041,China)Abstract Objective:To investigate the intervention effect of the combination of berberine and oral probioticformulations on diarrhea-predominant irritable bowel syndrome(IBS-D),and to provide an experimental basis forthe possibility of combining the two drugs in clinical practice.Methods:A senna gavage combined with restraintstimulation-induced IBS-D mouse model was established,and after treatment with berberine and oral probioticformulations alone or in combination,the rate of weight change,Bristol stool score,abdominal withdrawal reflex(AWR)score,colonic histopathological changes and intestinal flora changes were used as indicators to evaluatethe intervention effects of drugs.Results:Berberine alone and in combination with oral probiotic formulationsreduced Bristol stool score and AWR score(P0.05),while oral probiotic formulations alone showed an advantagein restoring weight gain in IBS-D mice(P0.05).Observation of histopathological sections of the colon showedthat all medications reduced the extent of inflammation in the colon.Quantitative analysis of intestinal florashowed that the combination of berberine and oral probiotic formulations increased the relative content ofBifidobacteriumandLactobacillus(P0.05)and decreased the relative content ofEscherichia coli(P0.05).Conclusion:The combination of berberine and oral probiotic formulations has no antagonistic effects and hassome enhancement in improving intestinal flora dysbiosis.Key words irritable bowel syndrome;diarrhea;berberin;oral probiotic formulations66汕头大学医学院学报第36卷腹泻型肠易激综合征（diarrhea-predominantirritable bowel syndrome，IBS-D）是一种病因复杂的慢性功能性肠病1。临床上以对症治疗为主，疗效有限，给患者造成很大的困扰2。近年来肠道菌群失调在IBS-D的作用受到越来越多的关注3-4，其中口服益生菌制剂被许多指南和专家共识推荐作为IBS-D的辅助治疗5-7。黄连素，别名为小檗碱，是一种天然植物生物碱，具有抗菌、抗炎、止泻、调节肠道菌群等作用，被认为是一种能有效治疗IBS-D的药物8-10。在我国，黄连素和口服益生菌制剂的组合疗法亦见于临床常见腹泻及某些肠道菌群失调的疾病，但也有观点认为两者联用不合理，黄连素具有抗微生物活性，联用影响益生菌的效果。目前鲜见黄连素联用口服益生菌制剂治疗IBS-D及调节肠道菌群的报道。因此本研究以临床常用的双歧杆菌四联活菌片为代表性口服益生菌制剂，在动物实验中探索其与黄连素联用对IBS-D的干预效果，为临床上两药联用的可能性提供实验依据。1材料与方法1.1材料1.1.1动物昆明小鼠，30 只，56 周龄，雄性，购于汕头大学医学院实验动物中心。本研究经汕头大学医学院实验动物伦理委员会批准（文件号：SUMC2021-453）。1.1.2药物及试剂番泻叶购于恒青大药房，黄连素（通用名：盐酸小檗碱片，广东华南药业集团有限公司），双歧杆菌四联活菌片（杭州远大生物制药有限公司），异氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），粪便基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司），TB Green染料法标准型定量试剂盒（日本Takara公司），引物由上海生工生物有限公司合成。1.1.3仪器及设备5427R台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）、BX53荧光显微镜（日本Olympus公司）、NanoDrop 2000超微量分光光度计（美国赛默飞世尔科技公司）、QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。1.2方法1.2.1药物制备采用煎煮法提取番泻叶中的有效成分，制备番泻叶溶液。称取番泻叶100 g，加入1 000 mL冷蒸馏水浸泡30 min，大火煮开后小火煮沸10 min后过滤得到上清液，浓缩到0.5 g/mL（按生药量计），放置于4 冰箱保存。1.2.2模型建立小鼠适应性饲养7 d后，参考文献4，11的方法，通过冰番泻叶溶液灌胃（0.5gkg-1d-1）联合束缚应激（灌胃后用离心管固定小鼠，使之无法前后移动，持续1 h），持续2周，建立IBS-D小鼠模型。模型建立后，以体重变化率、Bristol 粪 便 性 状 评 分、腹 壁 撤 退 反 射（abdominal withdrawal reflex，AWR）评分及结肠组织病理变化等评估 IBS-D 小鼠模型是否建立成功。1.2.3分组及给药小鼠适应性喂养7 d后随机分为正常对照组、模型对照组、黄连素组、益生菌组、黄连素+益生菌组，每组6只。前4 d，益生菌组、黄连素+益生菌组灌胃益生菌混悬溶液（0.75 gkg-1d-1），其余各组灌胃相同体积灭菌蒸馏水。从第 5 天开始黄连素组灌胃黄连素溶液（0.1 gkg-1d-1），益生菌组灌胃益生菌混悬溶液（0.75 gkg-1d-1），黄连素+益生菌组先灌胃益生菌混悬溶液（0.75 gkg-1d-1），1 h后灌胃黄连素溶液（0.1 gkg-1d-1），正常对照组和模型对照组灌胃相同体积灭菌蒸馏水，共14 d。实验中黄连素和口服益生菌制剂的剂量根据治疗成人腹泻的剂量范围按照体表面积换算，并结合以往关于IBS-D 模型动物的最优剂量确定具体给药剂量。同时鉴于黄连素具有抗微生物的活性，为避免与口服益生菌制剂同时服用时影响其定植，给药时将两者隔开服用。1.2.4观察指标和检测方法一般情况：每天实验前观察各组小鼠的体重变化、毛发色泽、精神状态、饮食和粪便情况等。将实验第1天的小鼠体重作为基准体重，计算每天小鼠的体重变化率。体重变化率=(当日体重-基准体重)/基准体重100%。粪便性状：实验最后一天给药后，观察小鼠2、4、6 h的粪便性状。采用Bristol大便分类法对大便进行分类评分11：第1型1分，分散的类似于干球和坚果，难以排泄；第2型2分，腊肠状，但成块；第3型3分，腊肠状表面有裂纹；第4型4分，腊肠状或蛇形，光滑柔软；第5型5分，软团具有清晰的边缘，易于排泄；第6型6分，软片状，边缘不清或糊状；第7型7分，水样便或无固状物。第12型表示有便秘，第34型为正常粪67李少洁，等黄连素与口服益生菌制剂联用对腹泻型肠易激综合征的作用第 2期便，第57代表可能有腹泻。AWR 评分：以上实验结束后将小鼠禁食 18h，用异氟烷轻度麻醉小鼠。将润滑后的带气囊的6Fr儿童双腔导尿管插入小鼠结肠中，气囊末端距离肛门1 cm。给予每只小鼠球囊扩张2次，容量分别为0.5、0.7 mL，每个容量持续20 s，间隔4min，重复3次。AWR评分标准11：0分，小鼠情绪稳定；1 分，小鼠情绪不稳定，偶尔扭头；2分，腹背部肌肉略微收缩，腹部未抬离地面；3分，腹背部肌肉强烈收缩，腹部从地面抬起；4分，腹部肌肉强烈收缩，背部呈弓形，腹部、骨盆和会阴部从地面抬起。AWR评分是用于评价动物内脏敏感程度的重要指标12。结肠组织病理观察：实验结束后，用异氟烷麻醉小鼠后再进行颈椎脱臼处理，剖腹截取小鼠近端结肠1 cm左右，用4 预冷生理盐水将结肠内残留物清洗干净，沿纵轴剪开结肠，于4%多聚甲醇溶液中固定48 h，进行脱水、包埋、切片、HE染色，最后置于显微镜下观察，收集图像并进行分析。肠道菌群检测：无菌条件下采集200 mg小鼠盲肠内容物，保存于-80 冰箱。提取小鼠粪便基因组DNA，采用实时荧光定量PCR，以总肠道菌群为内参，检测各组小鼠双歧杆菌属、乳杆菌属、大肠杆菌等3种肠道重要菌群的相对含量。引物序列见表1，扩增条件为：95 预变性30 s，95 变性5 s，55 退火30 s，72 延伸30 s，40个循环。运用2-CT法计算肠道菌群的相对含量。1.3统计学方法应用SPSS 25.0统计软件进行分析。符合正态分布的计量资料以x s表示，多组间比较采用单因素方差分析。不同时间点小鼠体重变化率的比较采用重复测量的方差分析。双侧检验，检验水准=0.05。2结果2.1一般情况正常对照组小鼠一般情况良好，毛发整洁有光泽，精神状态及饮食无异常，粪便呈正常颗粒状。经诱导后，模型对照组表现出毛发竖立、易受刺激、精神萎靡、饮食量减少、腹泻等症状。其余各组上述症状均有不同程度改善，且以黄连素组和黄连素+益生菌组的效果较明显。2.2体重变化正常对照组小鼠体重呈明显上升趋势，经诱导后各组小鼠体重均低于正常对照组（P0.05）。上述结果初步证实了IBS-D模型的成功建立。与模型对照组相比，益生菌组体重呈缓慢上升的趋势（P0.05），而黄连素组和黄连素+益生菌组从第7天起体重呈下降趋势（P0.05）。与黄连素组相比，黄连素+益生菌组的下降趋势较小（P0.05）。可见，口服益生菌制剂可部分逆转造模对体重增长的抑制。结果见图1。2.3Bristol粪便性状评分与正常对照组相比，模型对照组2、4、6 h的Bristol粪便性状评分均升高（P0.05），且评分均在6分以上，表明IBS-D建模成功。黄连素组和黄连素+益生菌组各时间点Bristol评分均下降（P0.05），而益生菌组仅在2 h时，Bristol 评分下降（P0.05）。结果见图2。2.4AWR评分与正常对照组比较，模型对照组球囊扩张容量为0.5 mL和0.7 mL时的AWR评分均升高（P0.05），表明模型对照组的内脏敏感度高于正常对表1肠道细菌引物序列肠道菌群总肠道菌群双歧杆菌属乳杆菌属大肠杆菌引物序列正向：5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3反向：5-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3正向：5-GGGTGGTAATGCCGGATG-3反向：5-TAAGCGATGGACTTTCACACC-3正向：5-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3反向：5-CACCGCTACACATGGAG-3正向：5-CATTGACGTTACCCAGAAGAAGC-3反向：5-CTCTACGAGACTCAAGCTTGC-3CON：正常对照组；IBS-D：模型对照组；BBR：黄连素组；YSJ：益生菌组；MIX：黄连素+益生菌组；1）与正常对照组相比，P0.05；2）与模型对照组相比，P0.05；3）与黄连素组相比，P0.05；n=6。图1各组小鼠体重变化情况68汕头大学医学院学报第36卷照组，建模成功。治疗后，与模型对照组比较，黄连素组和黄连素+益生菌组各球囊扩张容量的AWR评分均下降（P0.05）。结果见图3。2.5结肠组织病理学结肠病理显示（图4），模型对照组小鼠结肠形态正常，黏膜层炎性细胞浸润增多，仅表现为肠道的低度炎症反应，且无明显器质性病变，符合IBS-D结肠病理特点。与模型对照组相比，治疗后各组小鼠结肠出现炎性细胞浸润的范围较小。A：给药后2 h；B：给药后4 h；C：给药后6 h；CON：正常对照组；IBS-D：模型对照组；BBR：黄连素组；YSJ：益生菌组；MIX：黄连素+益生菌组；1）与正常对照组相比，P0.05；2）与模型对照组相比，P0.05；3）与黄连素组相比，P0.05；4）与益生菌组相比，P0.05；n=6。图2各组小鼠Bristol评分的变化A：球囊扩张容量为0.5 mL；B：球囊扩张容量为0.7 mL；CON：正常对照组；IBS-D：模型对照组；BBR：黄连素组；YSJ：益生菌组；MIX：黄连素+益生菌组；1）与正常对照组相比，P0.05；2）与模型对照组相比，P0.05；3）益生菌组相比，P0.05；n=6。图3各组小鼠AWR评分的变化A：正常对照组；B：模型对照组；C：黄连素组；D：益生菌组；E：黄连素+益生菌组；HE染色，100，箭头指示该位置炎性细胞浸润。图4各组小鼠结肠组织病理变化69李少洁，等黄连素与口服益生菌制剂联用对腹泻型肠易激综合征的作用第 2期2.6小鼠肠道菌群的变化肠道菌群实时荧光定量PCR结果显示，与正常对照组相比，模型对照组双歧杆菌属和乳杆菌属的相对含量显著减少（P0.05），大肠杆菌的相对含量显著升高（P0.05）。与模型对照组相比，给药各组均不同程度增加双歧杆菌属的相对含量（P0.05），其中黄连素组和黄连素+益生菌组的差异具有统计学意义（P0.05）；给药各组均不同程度增加乳杆菌的相对含量（P0.05），其中益生菌组和黄连素+益生菌组的差异具有统计学意义（P0.05）；益生菌组和黄连素+益生菌组均降低了大肠杆菌的相对含量（P0.05）。结果见图5。3讨论本研究采用公认的精神应激结合外周刺激的IBS-D动物模型，通过观察症状、检测结肠病理改变以及肠道菌群的变化探讨了黄连素联用口服益生菌制剂对IBS-D的干预效果。结果显示两者联用未出现拮抗作用，在改善肠道菌群失调方面具有一定的增强作用，表明两者联用治疗IBS-D是可行的。黄连素作为从中药黄连中提取的一种生物碱，具有消炎、抗菌等作用。其抗菌谱广，体外对多种革兰氏阳性及阴性菌均具抑制作用，但抗菌作用较弱。由于肠道吸收少，临床上主要用于治疗胃肠炎、细菌性痢疾等肠道感染8。近年越来越多的研究表明，黄连素可以通过修复肠上皮屏障、抑制肠道炎症通路、调节肠道菌群以及类阿片受体激动作用等多途径治疗IBS-D13-16。本研究亦证实了黄连素能改善IBS-D模型小鼠的腹泻、内脏过敏、肠道轻度炎症、肠道菌群失调等症状。值得注意的是，经黄连素干预后，IBS-D小鼠反而出现体重下降，猜测可能与黄连素的降脂作用有关17。同时本研究发现口服益生菌制剂单用在改善IBS-D模型小鼠腹泻和内脏敏感性方面作用不明显，但能改善IBS-D的其他症状，包括恢复体重、改善肠道低度炎症、恢复肠道菌群失调等。黄连素作为抗菌剂，与口服益生菌制剂联用通常被认为会影响益生菌的效果。但我们的实验结果显示，与黄连素和口服益生菌制剂单用相比，两者联用并没有表现出拮抗作用，甚至具有一定的增强作用。同时已知肠道菌群代表了一个极其复杂的生态系统，越来越多的研究证明其与IBS-D关系密切，且可能是IBS-D的潜在发病机制之一15。因此，本研究探讨了黄连素和口服益生菌制剂对调节肠道菌群失调方面的效果，结果发现两者联用更能显著调节肠道菌群失调。我们后续的研究也初步显示，临床用量的黄连素对几种益生菌的抑制作用很弱，这可能是黄连素未表现出与益生菌拮抗的原因；反而通过抑制有害菌，表现出与益生菌协同调节肠道菌群的作用。说明了两者联用可能是通过调节肠道菌群失调来发挥协同抗IBS-D的作用。本研究仅从肠道菌群方面初步探讨了两者联用的可能作用机制，两药联用是否能通过修复肠上皮屏障、抑制肠道炎症等发挥作用，本文尚未涉及，这也是本文的一个不足之处。基于上述发现，我们认为黄连素和口服益生菌制剂联用治疗IBS-D是可行的，在临床上用于治疗IBS-D具有潜在的应用前景。今后的研究将进一步深入探讨黄连素联合口服益生菌制剂的作用靶点和通路，为IBS-D的临床用药提供依据。A：双歧杆菌属；B：乳杆菌属；C：大肠杆菌；CON：正常对照组；IBS-D：模型对照组；BBR：黄连素组；YSJ：益生菌组；MIX：黄连素+益生菌组；1）与正常对照组相比，P0.05；2）与模型对照组相比，P0.05；3）与黄连素组相比，P0.05；4）与益生菌组相比，P0.05；n=6。图5 各组小鼠粪便双歧杆菌属、乳杆菌属、大肠杆菌的相对含量70汕头大学医学院学报第36卷参考文献1OWICIMSKA J,SZYMLAK A,ROCZNIAK W,et al.New insights into the pathogenesis and treatment ofirritable bowel syndromeJ.Adv Med Sci,2017,62(1):17-30.2LAZARAKI G,CHATZIMAVROUDIS G,KATSINELOSP.Recent advances in pharmacological treatment ofirritable bowel syndromeJ.World J Gastroenterol,2014,20(27):8867-8885.3KASSINEN A,KROGIUS-KURIKKA L,MKIVUOKKOH,et al.The fecal microbiota of irritable bowel syndromepatients differs significantly from that of healthy subjectsJ.Gastroenterology,2007,133(1):24-33.4ZHU H M,LI L,LI S Y,et al.Effect of water extract fromBerberisheteropodaSchrenkrootsondiarrhea-predominantirritablebowelsyndromebyadjustingintestinal floraJ.J Ethnopharmacol,2019,237:182-191.5FUKUDOS,OKUMURAT,INAMORIM,etal.Evidence-based clinical practice guidelines for irritablebowel syndrome 2020J.J Gastroenterol,2021,56(3):193-217.6SONG K H,JUNG H K,KIM H J,et al.Clinical practiceguidelines for irritable bowel syndrome in Korea,2017revised editionJ.J 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