黄精提取物改善D-半乳糖所致衰老小鼠器官功能及机制研究.pdf

解小芬，胡光线，潘露，等.黄精提取物改善 D-半乳糖所致衰老小鼠器官功能及机制研究 J.食品工业科技，2023，44（18）：449457.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022110220XIE Xiaofen,HU Guangxian,PAN Lu,et al.Effect of Polygonatum sibiricum Extract in Improving the Organ Function of D-Galactose-induced Aging Mice and Its MechanismJ.Science and Technology of Food Industry,2023,44(18):449457.(in Chinesewith English abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022110220 营养与保健 黄精提取物改黄精提取物改善善 D-半乳糖所致衰老小鼠器官半乳糖所致衰老小鼠器官功能及机制研究功能及机制研究解小芬1,2，胡光线2，潘露3，伍徐娴2，周丹1,2，陈九琼2，匡梦岚2，叶兰1，秦臻1,*，许键炜1,2,*（1.贵州医科大学基础医学院，贵州贵阳 550025；2.贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心，细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室，贵州省再生医学重点实验室，贵州贵阳 550025；3.贵州医科大学口腔医学院，贵州贵阳 550025）摘要：目的：旨在探讨黄精提取物（Polygonatum sibiricum extract，PSE）对 D-半乳糖（D-galactose，D-gal）致衰老小鼠重要脏器的保护作用及其潜在的分子机制。方法：将小鼠随机分为五组（n=10）：对照组、D-gal（500 mg/kg）组、PSE 低（0.5 g/kg）、中（1 g/kg）、高（2 g/kg）剂量组。测定小鼠器官指数（胸腺、脾脏、肝脏、肾脏）；测定血清中肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、尿酸（UA）、尿素（UREA）、肌酐（CREA）、尿素肌酐比值（BUN/Scr）、肾小球滤过率（eGFR）活性；HE 及 Masson 染色观察各组小鼠皮肤、肝脏、肾脏、心脏、大脑、肺等器官病理学变化；用 Real-timePCR 法检测各组小鼠肝脏、肾脏、心脏、大脑等组织中 p53、p16、p21、RB、HO-1、Nrf2 及 Keap1 mRNA 的表达水平。结果：与 D-gal 组相比，PSE 各剂量组胸腺、脾脏、肝脏和肾脏指数均升高（P0.05）；此外，在各治疗组中，PSE 降低了（P0.05）小鼠血清中 CK、CK-MB、ALT、AST、ALP、UA、UREA、CREA 和 BUN/Scr 水平，升高了 eGFR（P0.05）水平；HE 及 Masson 染色发现，PSE 能减轻 D-gal 对小鼠重要器官造成的病理损伤；与对照组比较，模型组肝、肾、心、脑中 p53、p16、p21、RB、Keap1 mRNA 表达升高（P0.05），HO-1、Nrf2mRNA 表达降低（P0.05），与 D-gal 组比较，PSE 各治疗组小鼠肝脏、肾脏、心脏、大脑组织中 p53、p16、p21、RB、Keap1 mRNA 降低（P0.05），HO-1、Nrf2 mRNA 升高（P0.05）。结论：PSE 具有延缓衰老作用，其机制可能与其抑制 p53/p21 和 p16-RB 通路以及 Keap1/Nrf2/HO-1 通路有关。关键词：黄精提取物，抗衰老，p53/p21 信号通路，p16-RB 信号通路，Keap1/Nrf2/HO-1 信号通路本文网刊:中图分类号：TS201.4 文献标识码：A 文章编号：10020306（2023）18044909DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022110220EffectofPolygonatumsibiricumExtractinImprovingtheOrganFunctionofD-Galactose-inducedAgingMiceandItsMechanismXIEXiaofen1,2，HUGuangxian2，PANLu3，WUXuxian2，ZHOUDan1,2，CHENJiuqiong2，KUANGMenglan2，YELan1，QINZhen1,*，XUJianwei1,2,*（1.School of Basic Medical Science,Guizhou Medical University,Guiyang 550025,China；2.Guizhou Medical University Tissue Engineering and Stem Cell Experimental Center,National Local Joint EngineeringLaboratory of Cell Engineering and Biomedicine Technology,Guizhou Province Key Laboratory of RegenerativeMedicine,Guiyang 550025,China；收稿日期：20221121 基金项目：中国医学科学院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（2018PT31048，2019PT310013）；贵州省科学技术基金（黔科合 J 字20112230 号）；贵州医科大学博士启动基金（校博合 J 字 2020018 号）。作者简介：解小芬（1994），女，硕士研究生，研究方向：中药、民族药抗炎药理，干细胞与再生，E-mail：。*通信作者：许键炜（1979），男，博士，副教授，研究方向：中药、民族药抗炎药理，干细胞与再生，E-mail：。秦臻（1982），女，博士，副教授，研究方向：中药、民族药抗炎药理，E-mail：。第 44 卷 第 18 期食品工业科技Vol.44 No.182023 年 9 月Science and Technology of Food IndustrySep.2023 3.School of Stomatology,Guizhou Medical University,Guiyang 550025,China）Abstract：Objective:The purpose of this study was to explore the protective effects of Polygonatum sibiricum extract(PSE)on the important organs of D-galactose(D-gal)-induced aging mice and its potential molecular mechanisms.Methods:Themice were randomly divided into five groups(n=10):control group,D-gal(500 mg/kg)group,low-PSE dose(0.5 g/kg)group,medium-PSE dose(1 g/kg)group,and high-PSE dose(2 g/kg)group.The organ indices(thymus,spleen,liver,andkidney)were detected.The levels of creatine kinase(CK),creatine kinase isoenzyme(CK-MB),alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST),alkaline phosphatase(ALP),uric acid(UA),urea(UREA),creatinine(CREA),ureacreatinine ratio(BUN/Scr),and glomerular filtration rate(eGFR)in serum were measured.Pathological changes in theskin,liver,kidney,heart,brain,and lung of mice in different groups were analyzed by HE and Masson staining.Theexpressions of p53,p16,p21,RB,HO-1,Nrf2,and Keap1 mRNA in the liver,kidney,heart,and brain of each group ofmice were detected by real-time PCR.Results:The thymus,spleen,liver,and kidney indices were increased in each PSEtreatment group compared with those in the D-gal group(P0.05).Moreover,in each treatment group,PSE decreased(P0.05)the levels of CK,CK-MB,ALT,AST,ALP,UA,UREA,CREA,and BUN/Scr in mouse serum and increased thelevel of eGFR(P0.05).HE and Masson staining showed that PSE could reduce the pathological damage caused by D-galto the vital organs of mice.Compared with the blank group,the model group presented increased expression levels of p53,p16,p21,RB,and Keap1 mRNA in the liver,kidney,heart,and brain(P0.05)and decreased HO-1 and Nrf2 mRNA(P0.05).Compared with the D-gal group,mice in each PSE treatment group exhibited decreased mRNA levels of p53,p16,p21,RB,and Keap1 in the liver,kidney,heart,and brain tissues(P0.05)and increased mRNA levels of HO-1 andNrf2(P0.05).Conclusion:PSE has anti-aging effects,and its mechanism may be related to its inhibition of the p53/p21,p16-RB,and Keap1/Nrf2/HO-1 pathways.Key words：Polygonatum sibiricum extract；anti-aging；p53/p21 signaling pathway；p16-RB signaling pathway；Keap1/Nrf2/HO-1 signaling pathway 根据最新统计数据，预计到 2050 年，全球 65 岁以上老年人口数量将增加 21.5%1，达到 15 亿2。衰老是一种无法避免的自然现象，也是一个持续的生理过程，并且伴随着细胞、组织和器官的物质、形态改变和功能退化3。衰老会加剧许多与年龄有关的各种疾病的发生，包括神经系统退行性变、心血管疾病等。虽然衰老不可逆转，但可通过多种措施来延缓衰老，如食疗、中药干预、加强运动等途径46。进入21 世纪后，随着全球老龄化日趋严重，由衰老和衰老相关疾病引起的健康问题日益突出。因此，尽快阐明衰老的机制，探寻有效的抗衰老药物，已成为刻不容缓的任务，有着重大的社会意义。黄精是百合科植物多花黄精（Polygonatumcyrtonema Hua）、黄精（Polygonatum sibiricum Red.）或滇黄精（Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.）的干燥根茎，被收载于 2020 版中国药典。黄精是一种传统经典的药食两用植物，具有补气养阴、益肾、健脾、润肺的功效7。其口感好，具有甜味和香味，可长期大量食用。黄精作为药物或膳食补充剂的应用历史可以追溯到 2000 多年前，当时它被记录在汉末的名医别录一书中89。现代研究表明黄精具有多种活性成分，包括黄精多糖、薯蓣皂苷元、凝集素和高异黄烷酮等化合物1012。现代药理学研究表明，黄精在抗菌、抗糖尿病、增强免疫力、抗疲劳、抗衰老等方面具有广泛的药理作用1315。目前仅有的研究报道黄精具有延缓大脑衰老的作用。可通过清除自由基、减少 A 的聚集、逆转突触结构改变、加速神经元的损伤修复与再生、改善学习记忆能力等来改善大脑衰老1619。本课题组前期研究表明，黄精可通过提高端粒酶活性，降低细胞 ROS 水平，减轻细胞氧化损伤来保护衰老大鼠骨髓内皮祖细胞（endothelialprogenitor cells,EPCs）的功能2021。但未进行体内实验研究黄精对衰老小鼠器官功能的影响及机制。因此，本研究利用-gal 诱导建立小鼠衰老模型，观察黄精提取物对衰老模型小鼠重要器官的保护作用，并探讨其抗衰老作用的分子机制，旨在为开发功能性食品和新型抗衰老及相关疾病的药物提供新思路，同时促进道地药材黄精的开发利用。1材料与方法 1.1材料与仪器SPF 级昆明小鼠 50 只雌雄各半，8 周龄，体重202 g，购自贵州医科大学实验动物中心（动物生产合格证号：SCXK（京）2019-0010），饲养于贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心标准动物房：室温2025，湿度 30%40%，光照明暗交替 12 h，自由饮水，常规饲料喂养；黄精饮片（20062701）贵州一品药业连锁有限公司；D-半乳糖（V900922-100 g）美国 Sigma 公司；trizol 试剂（15596026-100 mL）美国 Invitrogen 公司；逆转录（RT）试剂盒、荧光定量 PCR 试剂盒（RR047A-100T,RR820A-200T）TaKaRa 公司；PCR 引物Invtrogen 公司。Hc3016r 高速冷冻离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司；Gscan20 数字病理切片扫描仪日本 Hamamatsu 有限公司；JC-FD200 金属恒温孵育器德国 Eppendorf 公司；CFX96荧光定量 PCR 仪美国 Bio-Rad 公司；TBAFX8 全自动生化分析仪 450 食品工业科技2023 年 9 月上海瑞美电脑科技有限公司。1.2实验方法 1.2.1 黄精提取物（PSE）的制备取黄精饮片 15 g，粉碎，过 4 号筛；用 95%的乙醇提取三次；每次按1:10 的比例，提取温度为 80，提取时间为 1 h；收集三次粗液，冷却后过滤，浓缩至浸膏，制备得到PSE22。计算 PSE 得率为 23.48%，20 保存备用。用 UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS 鉴定 PSE 成分为皂苷类。1.2.2 分组、造模与治疗50 只小鼠随机分为正常组（Control 组）、模型组（D-gal 组）、PSE 低剂量组（L-PSE 组）、PSE 中剂量组（M-PSE 组）、PSE 高剂量组（H-PSE 组）。本次研究造模方法参照文献23，模型组、PSE 低、中、高剂量组小鼠颈背部皮下注射 500 mg/kg/d D-半乳糖构造衰老模型，连续8 周。第 4 周开始灌胃相应剂量的 PSE（低、中、高剂量组分别为 0.5、1、2 g/kg），连续给药四周，正常组皮下注射等量的生理盐水作为对照，正常组与模型组灌胃生理盐水。（皮下注射生理盐水是与 D-gal 对照，而灌胃生理盐水是与给药组进行对照）。贵州医科大学动物伦理委员会审查并批准实验程序（NO：2001976）。1.2.3 血清样本采集小鼠禁食 12 h，眼眶采血，3500 r/min 离心 15 min，吸取上清，20 保存备用。采用全自动血液生化分析仪测定肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、尿酸（UA）、尿素（UREA）、肌酐（CREA）、尿素肌酐比值（BUN/Scr）、肾小球滤过率（eGFR）活性。1.2.4 脏器指数的测定小鼠禁食 12 h，颈椎脱位处死小鼠，取出各组小鼠的肝、胸腺、脾脏、肾脏等组织，用生理盐水清洗干净脏器组织，称取脏器组织重量。1.2.5 组织病理学和纤维化分析取小鼠皮肤、肝脏、肾脏、心脏、大脑等组织进行 HE 和 Masson 染色，光学显微镜观察各组小鼠以上组织病理学和纤维化变化。1.2.6 Realtime-PCR 检测大脑、肝脏、肾脏、心脏组织中 p53、p16、p21、RB、HO-1、Nrf2、Keap1 mRNA表达水平取血后，颈椎脱位处死小鼠，取心脏，肝脏和肾脏和全脑组织。参照说明书用 Trizol 法提取大脑、肝脏、肾脏、心脏总 mRNA，用 Takara 逆转录试剂盒合成 cDNA。合成后，按照 TB Green Premix ExTaqTM试剂盒说明书依次添加试剂，再置于 PCR 仪进行基因扩增。分析 PCR 反应中各组样本的 Ct 值，并用 2Ct表示 mRNA 相对表达水平。p53、p16、p21、RB、HO-1、Nrf2、Keap1 及内参 GAPDH 序列见表 1。1.3数据处理所有数据均表示为平均值SD。使用 SPSS26.0进行统计分析。采用单因素方差分析（ANOVA）进行不同组间的比较，P0.05 为具有统计学意义。2结果与分析 2.1PSE 对 D-gal 致衰老小鼠脏器指数的影响免疫器官随着衰老会导致免疫器官指数的降低，这通常被用作评估衰老小鼠模型成功的标志。结果如表 2 所示，8 周的 D-gal 治疗导致胸腺和脾脏指数降低（P0.01，P0.05），D-gal 组小鼠胸腺和脾脏萎缩,说明造模成功。给予低中高剂量的 PSE 治疗则有所恢复胸腺指数和脾脏指数，L-PSE,M-PSE,H-PSE 胸腺指数极显著提高（P0.01），L-PSE 脾脏指数较模型组提高（P0.05），M-PSE,H-PSE 脾脏指数较模型组极显著提高（P0.01），说明 PSE 能延缓免疫器官衰老。肝、肾脏器指数的变化可体现肝脏和肾脏的衰老情况，一般机体正常时脏器指数比较恒定。当机体受外界因素影响时，引起脏器受损，其质量发生改变，故脏器指数也随之而改变。肝、肾脏器指数减小，表明肝肾损伤及其他退行性改变2425。与对照组相比,D-gal 组的肝脏指数、肾脏指数极显著降低（P0.01），说明连续 8 周的 D-gal 治疗对小鼠肝脏和肾脏造成了损伤。低中高剂量的 PSE 治疗能升高肝脏和肾脏指数，L-PSE、M-PSE、H-PSE 肝脏指数与模型组比较有所提高（P0.05），L-PSE,M-PSE,H-PSE 肾脏指数与模型组比较极显著提高（P0.01），说明 PSE 具有保护小鼠脏器损伤、延缓衰老的功能。2.2PSE 对 D-gal 致衰老小鼠生化指标的影响分析 PSE 对衰老小鼠血清中心肌酶水平的影响，肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）可反应心脏功能，是心肌坏死的指标26。CK 是心肌组织损伤的敏感指标之一，在心肌损伤期间呈上升趋势，临床上常作为急性心肌梗死的辅助诊断指标27。表 1 RT-PCR 引物序列Table 1 Primer sequence of RT-PCR基因正向引物（5-3）反向引物（5-3）p53TGGAAGGAAAATTTGTATCCCGAGTGGATGGTGGTATACTCAGAGp16ACATCAAGACATCGTGCGATATTCCAGCGGTACACAAAGACCAp21TGTCTTGCACTCTGGTGTCTGATCTGCGCTTGGAGTGATAGARBTCGATACGAGTACCAAGGTTGAACACGTCCGTTCTAATTTGCTGHO-1AAGCCGAGAATGCTGAGTTCAGCCGTGTAGATGGTACAAGGANrf2GTGCTCCTATGCGTGAATTACCTCTCCTGCGTATATCTKeap1TGCCCCTGTGGTCAAAGTGGGTTCGGTTACCGTCCTGCGAPDHAAGGTCATCCATGACAACTTTGGCACAGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT第 44 卷 第 18 期解小芬，等：黄精提取物改善 D-半乳糖所致衰老小鼠器官功能及机制研究 451 CK 主要分布于心肌细胞中，当心脏发生病理性损伤时，心肌细胞中的代谢酶会释放入血，血清中 CK 活性会迅速升高28。CK-MB 是 CK 的一种同工酶，主要存在于心肌细胞中。其含量在常态下较低，然而当心肌细胞受到损伤后，由于细胞和亚细胞室的解体而泄漏到细胞外液中，其水平会立即升高。是心肌损伤以及缺血坏死的早期标志物，其水平越高则表示心肌损伤加重2930。如表 3，在模型组小鼠的血清中观察到 D-gal 处理导致 CK、CK-MB 活性升高（P0.01），分别提高了 170.54%、67.23%,说明 D-gal 治疗损害了心脏功能。在本次研究中，用不同剂量 PSE 治疗可抑制血清中 CK、CK-MB 活性升高（P0.01，P0.05），PSE 低、中、高剂量组 CK 水平分别降低了66.67%、68.53%和 68.70%；CK-MB 水平分别下降42.44%、48.35%和 49.71%，表明 PSE 对 D-gal 诱导的心脏损伤具有保护作用。血清中 ALP、AST 和 ALT 水平是评价肝损伤的重要指标，连续 8 周的 D-gal 治疗会导致肝功能障碍，引起血清中ALP、AST 和ALT 水平显著升高3132。ALT 和 AST 是催化氨基酸和酮酸之间氨基转移的酶，主要位于肝细胞。当肝功能受损，例如葡萄糖和脂质代谢异常时，细胞膜的通透性增加，它们会释放到血液中，导致血清中 ALT 和 AST 水平升高。因此，血清 ALT 和 AST 水平是评估肝功能的重要且敏感的生化指标，可提示早期肝损伤，其异常升高可引起肝细胞损伤和坏死3334。ALP 是一种酸性水解酶，广泛存在于人体各组织细胞中，包括肝细胞。当肝组织发生病变坏死时，病变周围组织中肝细胞合成过度释放引起 ALP 排泄障碍，导致血清中 ALP 含量增加。因此 ALP 表达增多，提示机体肝脏功能受损35。如表 3 所示，与 Control 组相比，D-gal 组小鼠血清中 ALP、AST 和 ALT 水平显著上升（P0.01），分别升高了 51.34%、39.95%、28.72%，表明 D-gal 诱导肝脏发生损伤。与模型组相比，PSE 低中高剂量组均能显著降低小鼠血清中 ALP、AST 和 ALT 水平（P0.01，P0.05），L-PSE、M-PSE、H-PSE 组的 ALP活性分别降低了 32.16%、37.04%和 42.20%；AST活性分别降低了 22.41%、23.87%和 36.29%；ALT活性分别降低了 20.17%、27.04%和 33.47%。结果表明 PSE 对肝脏具有一定的保护作用。有文献报道，用 D-gal 治疗会导致肾脏损伤以及功能障碍，随后血清酶的活性或水平升高36，UA、UREA、CREA、BUN/Scr、eGFR 通常被认为是肾脏的关键损伤指标，其水平可以评估衰老肾脏的功能性和器质性损伤37。UREA 是机体蛋白质代谢的最终产物，是由肾脏排泄，其含量的高低由蛋白质的分解代谢与肾脏的排泄功能决定。在机体稳定的情况下，UREA 和肾小球滤过率（eGFR）功能成反比关系,UREA 升高，则 eGFR 降低，提示肾小球滤过功能减退38。血清 UA 过度生成/或排泄不足导致血清 UA过度积累可能会加重炎症反应，进而干扰肾功能39。CREA、BUN/Scr 水平明显异常时，引起机体内含氮化合物的代谢和肾小球滤过功能的异常改变，进而导致肾功能异常40。如表 4 所示，本研究表明，与对照组相比，D-gal 组小鼠的UA、UREA、CREA、BUN/Scr水平较高（P0.01，P0.05），eGFR 水平较低（P0.05），这与文献报道一致41。然而 PSE 灌胃治疗后小鼠血清中 UA、UREA、CREA、BUN/Scr 水平降低（P0.01，P0.05），eGFR 水平升高（P0.05），表明PSE 对 D-gal 诱导的肾损伤具有保护作用。2.3PSE 对 D-gal 致衰老小鼠脏器组织病理和胶原纤维的影响 2.3.1 PSE 对 D-gal 致衰老小鼠皮肤组织病理和胶原纤维的影响正常组小鼠皮肤结构正常完整，表皮厚度正常，皮脂腺副器官结构正常，胶原纤维束无明显断裂和溶解。D-gal 组的皮肤组织厚度不均匀，表皮缺失的部分明显更薄，纤维组织排列紊乱，有明显的碎裂。但是，在不同剂量 PSE 治疗的小鼠中，这些病理改变得到改善（图 1A）。胶原纤维（主要是胶原蛋白）是真皮的重要组成部分，随着年龄的增长，胶原 XSD表 2 PSE 对 D-gal 致衰老小鼠脏器指数的影响（，n=10）XSDTable 2 Effect of PSE on organ index of aging mice inducedby D-gal(,n=10)组别胸腺指数（mg/g）脾脏指数（mg/g）肝脏指数（mg/g）肾脏指数（mg/g）Control3.980.253.050.5361.192.6413.980.46D-gal1.970.57*2.110.47*51.973.05*11.630.50*L-PSE3.480.50#2.920.26#58.252.87#15.460.82#M-PSE3.460.37#4.370.54#58.434.32#14.951.11#H-PSE3.540.30#3.890.55#60.296.36#16.330.42#注：*与Control组相比差异显著（P0.05）；*与Control组相比差异极显著（P0.01）；#与D-gal组相比差异显著（P0.05）；#与D-gal组相比，差异极显著（P0.01）；表3表4同。XSD表 3 PSE 对 D-gal 致衰老小鼠血清生化指标的影响（，n=10）XSDTable 3 Effects of PSE on serum biochemical indexes in aging mice induced by D-gal(,n=10)组别心脏肝脏CK（U/L）CK-MB（U/L）ALP（U/L）AST（U/L）ALT（U/L）Control486.5226185.6728.3455.887.6463.298.9230.173.98D-gal1316.17221.58*310.5045.55*84.5713.03*88.5710.76*38.832.54*L-PSE438.6755.15#178.7157.86#57.3815.76#68.7119.54#31.004.00#M-PSE414.17142.46#160.3823.45#53.2515.01#67.4312.83#28.336.77#H-PSE412180.78#156.1418.943#48.8813.03#56.4310.29#25.835.76#452 食品工业科技2023 年 9 月纤维的含量会显着下降42。Control 组胶原纤维排列整齐且胶原沉积面积大，连续 8 周 D-gal 治疗导致胶原蛋白流失引起皮肤老化，不同剂量 PSE 治疗组胶原纤维排列整齐且胶原沉积面积较大（图 1B）。说明 PSE 可减缓皮肤组织结构的破坏，延缓皮肤组织衰老的进程。AB100 m100 m100 m100 m100 mControlD-galL-PSEM-PSEH-PSE图 1 小鼠皮肤的 HE 染色和 Masson 染色结果Fig.1 HE staining and Masson staining results of mouse skin注：A.衰老小鼠皮肤 HE 染色结果（10），B.衰老小鼠皮肤Masson 染色结果（20）。2.3.2 PSE 对 D-gal 致衰老小鼠肝脏组织病理和胶原纤维的影响由结果（图 2A）可知，小鼠在给予 D-gal 8 周后，其肝组织出现肝细胞变性和炎性细胞浸润等。采用不同剂量 PSE 治疗后，肝组织病理学改变得到恢复。此外，Masson 染色显示 D-gal 组肝脏组织纤维组织增生增加，纤维间隔形成；采用不同剂量 PSE 治疗后，肝组织纤维组织增生减小（图 2B）。说明 PSE 对 D-半乳糖引起的衰老小鼠肝损伤有一定保护作用。ABControl50 m100 m100 m100 m100 m100 m50 m50 m50 m50 mD-galL-PSEM-PSEH-PSE图 2 小鼠肝脏的 HE 染色和 Masson 染色结果Fig.2 HE staining and Masson staining results of mouse liver注：A.衰老小鼠肝脏 HE 染色结果（40），B.衰老小鼠肝脏Masson 染色结果（10）.2.3.3 PSE 对 D-gal 致衰老小鼠肾脏组织病理和胶原纤维的影响由结果（图 3A）可知，Control 组中，肾脏无任何病理损伤变化。注射 D-gal 可导致正常肾小球数量减少，肾小管硬化、萎缩、水肿、空泡变性和肾间质纤维。经过不同剂量 PSE 治疗，可减轻以上病理损伤。Control 组肾脏组织胶原沉积面积较小；而衰老模型组肾脏组织可见大量胶原纤维，胶原沉积面积大。经过不同剂量 PSE 治疗，可减轻以上纤维化程度（图 3B）。说明 PSE 对 D-半乳糖引起的衰老小鼠肾损伤有一定保护作用。ABControlD-galL-PSEM-PSEH-PSE图 3 小鼠肾脏的 HE 染色和 Masson 染色结果Fig.3 HE staining and Masson staining results of mouse kidney注：A.衰老小鼠肾脏 HE 染色结果（40），B.衰老小鼠肾脏Masson 染色结果（20）。2.3.4 PSE 对 D-gal 致衰老小鼠心脏组织病理和胶原纤维的影响正常组心脏纤维排列整齐，无心脏纤维断裂。D-gal 治疗组心肌组织损伤严重，PSE 改善了心脏病理变化，表现为减少了肌纤维断裂，核大小不规则减少，核碎裂减少，心肌细胞收缩和溶解减少（图 4A）。此外，Masson 染色显示 PSE 能减少老化心脏的胶原沉积和纤维化（图 4B）。说明 PSE 对 D-半乳糖引起的衰老小鼠心脏损伤有一定保护作用。ABControlD-galL-PSEM-PSEH-PSE图 4 小鼠心脏的 HE 染色和 Masson 染色结果Fig.4 HE staining and Masson staining results of mouse heart注：A.衰老小鼠心脏 HE 染色结果（20），B.衰老小鼠心脏Masson 染色结果（20）。2.3.5 PSE 对 D-gal 致衰老小鼠肺组织病理和胶原纤维的影响对照组肺泡结构正常。D-gal 注射8 周后，HE 和 Masson 染色显示与对照组相比，D-gal 治疗组肺泡壁明显增厚，肺泡间隔塌陷、炎症细 XSD表 4 PSE 对 D-gal 致衰老小鼠血清生化指标的影响（，n=10）XSDTable 4 Effects of PSE on serum biochemical indexes in aging mice induced by D-gal(,n=10)组别肾脏UA（mg/dL）UREA（mg/dL）CREA（mg/dL）eGFR（mg/dL）BUN/Scr（mg/dL）Control106.6734.666.130.5211.921.33245.3831.53121.888.91D-gal167.517.52*7.500.94*13.900.37*236.886.28*150.5018.85*L-PSE124.3315.77#5.590.83#10.951.04#244.2512.91#123.8813.68#M-PSE116.6716.39#5.540.88#10.771.50#244.2511.21#120.6313.31#H-PSE112.6710.03#5.460.50#10.631.20#251.7540.41#119.6325.40#第 44 卷 第 18 期解小芬，等：黄精提取物改善 D-半乳糖所致衰老小鼠器官功能及机制研究 453 胞浸润、肺结构丧失和胶原蛋白沉积过多，而 PSE 治疗减轻了 D-gal 引起的肺结构损伤和胶原蛋白沉积（图 5）。说明 PSE 对 D-半乳糖引起的衰老小鼠肺损伤有一定保护作用。ABControlD-galL-PSEM-PSEH-PSE图 5 小鼠肺的 HE 染色和 Masson 染色结果Fig.5 HE staining and Masson staining results of mouse lung注：A.衰老小鼠肺 HE 染色结果（20），B.衰老小鼠肺 Masson染色结果（10）。2.3.6 PSE 对 D-gal 致衰老小鼠大脑组织病理的影响对照组椎体细胞形态正常，无明显病理改变。D-gal 组锥体细胞染色浓密，胞浆稀少，呈不规则三角形，形状不规则，核深染，胞浆嗜酸性到空泡化。采用不同剂量 PSE 治疗后，少部分锥体细胞出现结构损伤，其余细胞保持正常细胞结构，细胞质均匀，核仁明显，空泡化少见（图 6）。说明 PSE 对 D-半乳糖引起的衰老小鼠脑损伤有一定保护作用。ControlD-galL-PSEM-PSEH-PSE图 6 小鼠大脑的 HE 染色结果（40）Fig.6 HE staining results of mouse brain(40)2.4PSE 对 D-gal 致衰老小鼠重要脏器组织衰老相关基因的影响p53/p21 和 p16-RB 两条信号通路与细胞和组织衰老关系密切。当机体发生氧化应激时，细胞受到刺激后诱导 DNA 损伤，使 p53 上调，活化的 p53 诱导细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 p21 的上调，进而抑制细胞周期阻遏物（CDK6，CDK4，cyclinD1）的激活，导致去磷酸化和细胞周期抑制因子视网膜母细胞瘤（RB）的激活，这与细胞周期停滞引发的细胞衰老密切相关4344。同时 D-半乳糖引起氧化应激导致小鼠体内发生 DNA 损伤，从而使 p16 上调，被上调的p16 与细胞周期阻遏物（CDK6，CDK4,cyclinD1）结合后去抑制 RB 的磷酸化，从而引起细胞衰老4546。结果显示：与 Control 组相比，衰老模型组小鼠肝脏、大脑、肾脏、心脏组织中 p53、p16、p21 和 RB mRNA均增加（P0.05，P0.05），H-PSE 组大脑组织中 p53、p16、p21 和 RB 极显著降低（P0.01）（图 7A）。而在肝脏、肾脏、心脏组织中 PSE 三个剂量组与模型组相比，p53、p16、p21 和 RB 均具有统计学意义（P0.05，P0.01）。其原因有可能是PSE 对不同的组织器官具有剂量差异。以上结果说明 PSE 可能通过抑制 p53-p21 和 p16-RB 信号通路的活化，进而发挥其抗衰老和多组织保护作用。1.5A1.0*#衰老相关基因相对表达量0.50.0p53p