-(12)C-(6+)辐射黄瓜M1代诱变效应研究_蔡世娟.pdf

河北工业大学学报JOURNAL OF HEBEI UNIVERSITY OF TECHNOLOGY2023 年 2 月February 2023第 52 卷 第 1 期Vol.52 No.112C6+辐射黄瓜M1代诱变效应研究蔡世娟，苏晓静，秦垒，曹天光（河北工业大学 理学院，天津 300401）摘要利用12C6+重离子对自交系黄瓜种子（18C-1）进行60 Gy、80 Gy、100 Gy、120 Gy剂量辐射，通过对种子发芽势、发芽率、发芽指数、成苗率、植株性状和功能、果实产量和品质以及 SSR 分子标记分析，探究重离子辐射黄瓜M1代种子生物学效应。结果表明，从辐射种子活力和成苗率上分析，辐射对种子活力和成苗率有显著地抑制作用，且随辐射剂量增加呈现先降后升变化趋势；从植株性状和功能上分析，高剂量辐射（100 Gy和120 Gy）植株受损严重不利于后代有效变异筛选；从株型的差异显著性和单株聚类图上分析，辐射对幼苗株型影响效应显著，且辐射剂量越接近影响效应越相似；从果实产量和品质上分析，60 Gy组筛选到果实性状优良、品质高的正向突变株；从SSR分子标记上分析，重离子辐射能诱发黄瓜基因组变异，其中120 Gy组尤为突出，60 Gy次之。综上所述，12C6+辐射对黄瓜M1代生物学性状和基因组DNA都产生显著影响，确定60 Gy为最适诱变剂量并筛选出正向突变株。本研究将为后续黄瓜诱变育种研究以及种质资源创新奠定基础。关键词黄瓜；重离子辐射；种子萌发指标；田间性状；SSR分子标记中图分类号Q947.9文献标志码AStudy on mutagenic effect of12C6+radiation on M1 Generation ofCucumberCAI Shijuan,SU Xiaojing,QIN Lei,CAO Tianguang（School of Science,Hebei University of Technology,Tianjin 300401 China）AbstractUsing12C6+heavy ion to radiate the seeds of inbred Cucumber(18C-1)in 60 Gy,80 Gy,100 Gy and 120 Gydoses,the biological effects of heavy ion radiation on M1 Generation of Cucumber were studied by analyzing the seed germination potential,germination rate,germination index,seedling rate,plant character and function,fruit yield and quality and SSR molecular markers.The results showed that,from the perspective of radiation seed vigor and seedling rate,radiation significantly inhibited the seed vigor and seedling rate,and showed a trend of decreasing first and then increasingwith the increase of radiation dose;from the analysis of plant character and function,high dose radiation(100 Gy and120 Gy)seriously damaged the plants,which was not conducive to the effective variation screening of offspring;from theanalysis of plant type difference significance and single plant cluster diagram,the results showed that the effect of radiation on the plant type of seedlings was significant,and the closer the radiation dose was,the much more similar the effectwas;from the analysis of fruit yield and quality,the positive mutants with good fruit characters and high quality werescreened from the 60 Gy group;from the SSR molecular marker analysis,the heavy ion radiation could induce Cucumbergenome variation,especially in the 120 Gy group,followed by the 60 Gy group.In conclusion,12C6+radiation had a significant impact on the biological characteristics and genomic DNA of M1 Generation of Cucumber.60 Gy was determined asthe optimal mutagenic dose and the positive mutant was screened out.This study will lay a foundation for the further research of Cucumber mutation breeding and germplasm resource innovation.Key wordsCucumber;heavy ion radiation;seed germination index;field character;SSR molecular marker文章编号：1007-2373（2023）01-0013-08DOI：10.14081/ki.hgdxb.2023.01.002收稿日期：2020-03-11基金项目：河北省高等学校科学技术研究项目（ZD2017023）第一作者：蔡世娟（1993），女，硕士研究生。通信作者：耿金鹏（1980），男，副教授，。蔡世娟，等：12C6+辐射黄瓜M1代诱变效应研究河北工业大学学报14第 52 卷0引言黄瓜属葫芦科黄瓜属草本植物，世界十大重要蔬菜作物之一，具有丰富的营养价值，由于自然侵蚀和长期定向改良，黄瓜栽培品种的遗传背景日渐狭窄，其遗传多样性远低于同属甜瓜，对良种选育工作造成一定阻碍。辐射诱变育种具有突变频率高、突变频谱宽、育种周期短、打破不良性状连锁等优势1，其中重离子诱变技术因其独特的物理学、生物学特性成为诱变育种研究中重要手段，在基因功能研究、优质材料选育及诱变生物学效应上均取得显著成效2-4。依据材料辐射敏感性确定最适诱变剂量是诱变育种工作的首要环节，其中种子发芽势、发芽率、发芽指数、成苗率、植株性状和功能（育性）以及果实产量和品质均是衡量植物辐射敏感性的重要指标。以往研究表明，不同品种或同一品种不同基因型对同一诱变源的辐射敏感性存在显著差异5。因此针对供试材料需通过实验重新确定最适诱变剂量。此外，突变材料的筛选在功能基因研究、遗传学分析、优良品种培育上也发挥着重大作用。随着生物技术的发展，对诱变材料的评估已从早期的形态学标记、细胞标记、生化标记发展到DNA分子标记，在众多分子标记技术中，SSR标记技术具有丰富性、共显性、稳定性等诸多优势，在种群遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位等诸多方面展现出强大功效6-9。在以往研究中，张俐等10采用SSR标记研究12C6+辐射玉米自交系材料的遗传多样性，发现重离子辐射对玉米遗传变异有影响，并证实SSR是研究辐射玉米遗传变异的有效工具；杨瑰丽等11采用SSR标记发现12C6+辐射水稻后代突变株和原材料遗传多样性存在显著差异。然而到目前为止，利用SSR标记对12C6+辐射诱变黄瓜的遗传多样性研究还鲜见报道。本研究以不同剂量12C6+辐射黄瓜种子为实验材料，将种子发芽试验、田间试验、生理实验、分子实验相结合分析辐射黄瓜M1代生物学效应，确定种子辐射敏感性并筛选正向突变株，以期选育出产量高、品质好的新品种，并为后续黄瓜诱变育种工作奠定基础。1材料与方法1.1实验材料辐射实验材料：河北工业大学理学院生物物理研究所选育的黄瓜自交系种子18C-1。果实Vc材料：从对照组和辐射组采摘生长8 d商品瓜果实。分子实验材料：从对照组和辐射组随机采集幼嫩芽尖，ddH2O冲洗干净吸水纸吸干表面水分后置于-80 冰箱保存，用于后续分子实验。1.2辐射实验将供试黄瓜种子用橡皮泥固定在塑料盘上，胚乳朝上单层放置正对真空封口膜，采用兰州重离子加速器国家实验室HIRFL加速器产生的低能12C6+束流经过镍窗、电离室、空气后对种子胚部进行辐射处理，注入剂量依次为60 Gy、80 Gy、100 Gy、120 Gy，以未经辐射的同批种子为对照。辐射参数为：离子能量为80 MeVum-1，传能线密度LET=30 keVum-1，射程17 mm，剂量率为60 Gymin-1。1.3发芽和种植实验将5组种子（每组40粒）5560 温汤浸种10 min12，期间定向匀速搅拌，自然降温到30 放置到恒温培养箱（30）浸泡8 h，捞出沥干用湿润纱布包裹放置培养皿中，随后置于恒温箱中（30）进行常规发芽实验。以根长2 mm为发芽标志，每12 h统计一次，以第1天、第3天发芽数量计算各组种子发芽势、发芽率、发芽指数，随后种植于V草炭V蛭石=51的育苗穴盘中。期间常规栽培管理。在幼苗生长18 d时统计各组成苗率、株高、茎粗数据并观测幼苗田间性状。发芽势（GE）=第1天发芽数/播种数（40粒）100%，（1）发芽率（GP）=第3天发芽数/播种数（40粒）100%，（2）发芽指数（GI）=Gt/Dt，（3）成苗率（SR）=18天成苗数/播种粒数（40粒）100%，（4）式中：Gt指时间t的发芽数；Dt指相应的发芽天数。蔡世娟，等：12C6+辐射黄瓜M1代诱变效应研究15第 1 期1.4果实维生素 C 含量测定将采摘的黄瓜果实样品进行编号，对照组：K1、K2、K3；60 Gy组：A1、A5、A9；80 Gy组：B1、B2；120 Gy组：D3；100 Gy组植株全部为簇状不育株，没有果实样品。将待测样本ddH2O冲洗干净并擦干，从果实中间位置沿径向切取10 g果肉，利用Vc在紫外光下有明显吸收在碱性环境中不稳定特性，在最大波长245 nm处测定样本溶液和碱处理溶液差值，通过标准曲线计算Vc浓度，并依据Vc浓度计算Vc含量Vc（紫外分光光度法）13。Vc（mg100 g-1）=cV总 V待测 100/V1W总 1000，（5）式中：c为依据标准曲线计算Vc浓度（ug mL-1）；V总=10 mL为吸取样品定容后体积；V待测=50 mL为待测样品总体积；100为100 g黄瓜；V1=0.2 mL为测定吸光度时吸取样品溶液体积；W总=10 g为测定黄瓜样本质量。1.5DNA 提取与检测采用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒（DP 305）离心吸附柱法对样本DNA进行提取，紫外分光光度法和1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度、纯度、完整性。1.6PCR 扩增及检测随机选取40对引物13，纯化方式为HPLC，由上海生物工程有限公司合成。PCR反应体系：共25 ul；正、反向引物（10 umol）各1 ul；2 Rea