PCV2_Cap蛋白原核表达、纯化及多克隆抗体的制备_李钰昌.pdf

黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报第 35 卷收稿日期：2022-05-17基金项目：黑龙江省自然科学基金联合引导项目（LH2019C046）。作者简介：李钰昌（1997-），男，黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院 2019 级硕士研究生。通信作者：曹宏伟，女，教授，博士研究生导师，Email：；肖莉杰，女，副教授，硕士研究生导师，E-mail：。PCV2 Cap 蛋白原核表达、纯化及多克隆抗体的制备李钰昌1，郑亮1，2，张华1，2，3，吴志军1，2，3，肖莉杰1，2，3，曹宏伟1，2，3（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院；3.黑龙江八一农垦大学生物技术中心）摘要：猪圆环病毒 2 型是一种常见的猪感染性病毒，Cap 蛋白为猪圆环病毒 2 型的核衣壳蛋白，也是该病毒最主要的结构蛋白，是目前猪圆环病毒 2 型基因工程疫苗研制的关键蛋白。研究构建了 Cap 蛋白原核表达质粒 pET28a-His-Cap，转化Transetta（DE3）表达菌株，IPTG 诱导表达，经 SDS-PAGE 及蛋白免疫印迹试验验证，重组蛋白主要以可溶性形式表达，少数为包涵体蛋白。以 Ni-NTA 树脂进行蛋白纯化，纯化后蛋白浓度为 629 g mL-1，采用透析袋浓缩将重组蛋白浓缩，浓缩后蛋白终浓度为 1.8 mg mL-1。将重组蛋白与弗氏佐剂等体积混合，充分乳化后制备抗原，免疫兔子采集全血，分离血清。经蛋白免疫印迹试验，该多抗与重组蛋白存在免疫反应性，ELISA 检测抗体效价可达 132 000，IFA 试验证明该多抗能够特异性识别猪圆环病毒 2 型。Cap 蛋白多克隆抗体的成功制备，为后续猪圆环病毒 2 型基因工程疫苗制备过程中验证 Cap 体外蛋白表达提供了材料。关键词：PCV2 Cap 蛋白；原核表达；多克隆抗体中图分类号：S828；S852.65+1文献标识码：A文章编号：1002-2090（2023）01-0078-06Prokaryotic Expression and Purification of PCV2 Cap Protein and Preparation ofPolyclonal AntibodyLi Yuchang1，Zheng Liang1，2，Zhang Hua1，2，3，Wu Zhijun1，2，3，Xiao Lijie1，2，3，Cao Hongwei1，2，3（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University；3.Biotechnology Center，Heilongjiang Bayi Agricultural University）Abstract：Porcine circovirus type 2 was a common porcine infectious virus.The Cap protein was the nucleocapsid protein of porcinecircovirus type 2，and also the most important structural protein of the virus.It was currently the genetic engineering of porcinecircovirus type 2 key protein for vaccine development.The Cap protein prokaryotic expression plasmid pET28a-His-Cap wasconstructed，transformed into Transetta（DE3）expression strains，and induced by IPTG.It was verified by SDS-PAGE and Westernblot experiments that the recombinant protein was mainly expressed in a soluble form，with a few inclusion bodies.protein.The proteinwas purified with Ni-NTA resin，and the purified protein concentration was 629 g mL-1.The recombinant protein was concentratedby dialysis bag concentration，and the final concentration of the concentrated protein was 1.8 mg mL-1.The recombinant protein wasmixed with Freunds adjuvant in equal volumes，and the antigen was prepared after fLl emLsification.The rabbits were immunizedto collect whole blood and separate the serum.Western blotting test showed that the polyclonal antibody was immunoreactive with therecombinant protein.The antibody titer detected by ELISA could reach 132 000.The IFA test proved that the polyclonal antibody canspecifically recognize porcine circovirus type 2.The successful preparation of Cap protein polyclonal antibody provided material forthe verification of Cap protein expression in vitro during the subsequent preparation of porcine circovirus type 2 geneticallyengineered vaccine.Key words：PCV2 Cap protein；protein expression and purification；polyclonal antibodydoi:10.3969/j.issn.1002-2090.2023.01.013第 35 卷第 1 期2023 年2 月黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报Journal of Heilongjiang Bayi Agricultural University35（1）：7883Feb.2023第 1 期猪圆环病毒（PCV）单链环状 DNA 病毒，大小约1.76 kb1，病毒粒子为正二十面体对称，是现有哺乳动物易感病毒中最小的一种2-3。根据血清型的不同，PCV 可以分为四种：PCV1（猪圆环病毒 I 型）、PCV2（猪圆环病毒型）、PCV3（猪圆环病毒 III 型）、PCV4（猪圆环病毒 IV 型）。其中，PCV1 无致病性，PCV3 的致病性尚未明确，PCV4 是于 2019 年在中国湖南省发现的一种新型圆环病毒，可感染各年龄段的猪，感染后临床症状有繁殖障碍，母猪流产、产死胎和腹泻，呼吸系统和神经系统病症等5。PCV2 感染后会导致宿主猪患有 PCVD（猪圆环病毒病）4，该病威胁着全球养猪业，是当今在国际上倍受关注的动物疫病之一6。PCV2 发现于 1998 年，是一种新兴的猪病原体7-8，与 PCV2 相关的疾病被称为 PMWS（断奶仔猪多系统衰弱综合征）。除了 PMWS 之外，PCV2 还与 PDNS（猪皮炎肾病综合征）、PRDC（猪呼吸道疾病综合征）、CT（新生仔猪先天震颤）等疾病密切相关9-12，这些疾病命名为猪圆环病毒病（PCVD）13-14。PCV2 基因组包含十一个 ORFs，病毒基因组正链包括 ORF1、ORF5、ORF7 和 ORF10，负链则包括 ORF2、ORF3、ORF4、ORF6、ORF8、ORF9、ORF11。在病毒 11 个开放阅读框中，ORF1 及 ORF2 是目前研究最为深入的重要阅读框。ORF1 的编码产物为 Rep 蛋白及 Rep 蛋白，两种蛋白作为复制酶蛋白，它们均在病毒复制过程中发挥重要作用，Rep 和 Rep蛋白都具有与典型滚环复制（RCR）相关的 3 个保守基序，一旦它们的结构发生变化，则病毒的复制过程也会随之发生一系列变化15。ORF2 编码产物为 Cap 蛋白，作为其核衣壳蛋白，其与 PCV2 免疫原性密切相关16，也是最主要的结构蛋白，倍受研究人员关注。研究表明，ORF3 基因的编码产物，在诱导细胞凋亡方面发挥关键作用17；ORF4 基因大小为 180 bp，有报道称，其所表达的蛋白，与 Caspase 的活性及 PK15 细胞的凋亡相关。ORF1、ORF6、ORF7、ORF8 基因编码产物在病毒复制过程中发挥作用，ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF11 等基因编码产物则与病毒入侵机体后提高病毒的致病力有关18-19。PCV2 Cap 蛋白是一种高度保守的蛋白，经研究人员比对发现，在不同的病毒分离株中，其氨基酸同源性高达 99%20。PCV 的类型特异性可能是由各自的 Cap 蛋白决定，由此也可以见得，Cap 蛋白在猪圆环病毒中扮演的角色是至关重要的。同时，Cap 蛋白也是研制 PCV2 基因工程亚单位疫苗的理想靶抗原21。利用杆状病毒表达系统，以表达 Cap 蛋白病毒感染昆虫细胞，结果发现在病毒感染后期，Cap 蛋白在被感染的昆虫细胞中能够形成病毒衣壳状颗粒22，这一现象可以间接证明 Cap 蛋白为 PCV2 一种主要的结构蛋白。试验进行了 Cap 蛋白原核表达载体的构建，重组蛋白进行表达纯化以及抗原制备等试验，免疫北京大耳白兔，成功制备了兔抗型猪圆环病毒 Cap蛋白的多克隆抗体，为 PCV2 疫苗研发过程中相关病原学检测提供了良好的生物学材料。1材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞、质粒、菌种及动物猪肾上皮细胞（PK15）、pET28a（+）载体、pMD18T-Cap 质粒由生物技术中心 509 试验室保存；Transetta（DE3）表达菌株购自北京全式金生物公司；DH5 感受态细胞购自生工生物工程（上海）有限公司；2 月龄北京大耳白兔一只，购自山东本明兔业有限公司。1.1.2 抗体与试剂山羊抗兔辣根酶标记 IgG（ZB-2301）、鼠抗 His单克隆抗体（TA-01）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；FITC 标记的山羊抗兔 IgG 购自碧云天生物技术有限公司（A0562），限制性内切酶（BamH、Xho）购自 NEB 公司；弗氏完全佐剂和不完全佐剂购自美国 Sigma 公司；质粒小提试剂盒（D6943-02）和胶回收试剂盒（D2500-02）购自 Omega 公司；Ni-NTA 树脂、PEG8000 购自生工生物工程（上海）有限公司。1.2 试验方法1.2.1 目的基因获取及原核表达质粒构建以试验室保存的 pMD18T-Cap 质粒为模板（Genebank ID：MT376362.1），根据 pET28a（+）载体信息及 Cap 基因序列，设计 Cap 基因对应的同源重组引物（上游引物：5-GCAAATGGGTCG