Sirt6通过调控P53_...4通路抑制骨骼肌细胞铁死亡_王瑶.pdf

中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2023，39（2）：335-344杂志网址：http:/Sirt6通过调控P53/SLC7A11/GPX4通路抑制骨骼肌细胞铁死亡*王瑶1，陈士坤1，段晨阳1，梁筱晗1，周成富1，秦珺1，侯东尧1，杜权1，2（1重庆医科大学附属第二医院麻醉科，重庆 400010；2重庆市老年医学临床研究中心，重庆 400010）摘要 目的：探讨骨骼肌细胞铁死亡的发生及sirtuin 6（Sirt6）对其调控的分子机制。方法：将C2C12小鼠成肌细胞分为对照组、erastin（Era；铁死亡诱导剂）组、Era+ferrostatin-1（铁死亡拮抗剂）组、Era+MDL-800（Sirt6激动剂）组和Era+OSS-128167（Sirt6抑制剂）组；通过细胞活力和C2C12成肌细胞肌源性分化情况观察铁死亡诱导剂及拮抗剂的影响；RT-qPCR和Western blot测定成肌细胞及肌管中Sirt6、肌萎缩标志物、铁死亡标志物的mRNA及蛋白表达水平；进一步检测P53蛋白乙酰化水平、胞内亚铁离子（Fe2+）、活性氧（ROS）、谷胱甘肽（GSH）及脂质过氧化指标Liperfluo；免疫荧光法检测肌管分化标志物肌球蛋白重链（MHC）荧光信号。结果：Era降低成肌细胞活力和肌管分化质量，伴有Sirt6的mRNA和蛋白水平下降（P0.05），肌萎缩标志物肌肉环指蛋白1（MuRF1）和肌萎缩F盒蛋白（MAFbx）表达增加（P0.05）。激活Sirt6可抑制P53蛋白第381位赖氨酸乙酰化，降低P53表达水平，提高溶质载体家族7成员11（SLC7A11）和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）水平，改善ROS、GSH、Fe2+和脂质过氧化等铁死亡特异性指标（P0.05），逆转铁死亡导致的肌肉负性变化。反之，抑制Sirt6将进一步加重铁死亡。结论：Sirt6可抑制P53蛋白乙酰化使其活性降低，通过调控P53/SLC7A11/GPX4信号通路抑制成肌细胞铁死亡，进而改善肌肉质量。关键词 肌肉减少症；sirtuin 6；铁死亡；去乙酰化中图分类号 R322.7+4；R363.2 文献标志码 A doi：10.3969/j.issn.1000-4718.2023.02.016Sirtuin 6 suppresses ferroptosis in skeletal muscle cells by regulating P53/SLC7A11/GPX4 pathwayWANG Yao1，CHEN Shikun1，DUAN Chenyang1，LIANG Xiaohan1，ZHOU Chengfu1，QIN Jun1，HOU Dongyao1，DU Quan1，2（1Department of Anesthesiology，the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400010，China；2Geriatric Medicine Clinical Research Center of Chongqing，Chongqing 400010，China.E-mail：）ABSTRACT AIM：To investigate the occurrence of ferroptosis in skeletal muscle cells and its molecular mechanisms.METHODS：Mouse C2C12 myoblasts were divided into control group，erastin（Era；ferroptosis inducer）group，Era+ferrostatin-1（ferroptosis antagonist）group，Era+MDL-800 sirtuin 6（Sirt6）agonist group，and Era+OSS-128167（Sirt6 inhibitor）group.The mRNA and protein expression levels of Sirt6，muscle atrophy markers and ferroptosis markers in C2C12 myoblasts or myotubes were determined by RT-qPCR and Western blot.Furthermore，acetylation levels of P53 protein，intracellular ferrous ion（Fe2+），reactive oxygen species（ROS），glutathione（GSH）and lipid peroxidation index Liperfluo were examined.Immunofluorescence revealed the intensity of myosin heavy chain（MHC；a biomarker of myotube differentiation）fluorescence signal.RESULTS：Treatment with Era reduced the viability of C2C12 cells and the quality of differentiated C2C12 myotube，accompanied by decreased Sirt6 mRNA and protein levels（P0.05）.The mRNA and protein levels of muscle atrophy F-box protein（MAFbx）and muscle ring-finger protein 1（MuRF1），markers of amyotrophy，were increased（P0.05）.Activation of Sirt6 inhibited acetylation of lysine 381 site in P53 protein，and decreased P53 expression.The Sirt6 agonist also increased solute carrier family 7 member 11（SLC7A11）and glutathione peroxidase 4（GPX4）expression levels，and altered ferroptosis specific indicators such as ROS，GSH，Fe2+and lipid per文章编号 1000-4718（2023）02-0335-10 收稿日期 2022-09-19 修回日期 2022-11-28*基金项目 重庆市出国留学人员创新自主项目（No.CX2021069）；重庆科卫联合项目（No.2020MSXM008）通讯作者 Tel：13883643222；E-mail：335oxidation（P0.05）.Conversely，inhibition of Sirt6 promoted ferroptosis.CONCLUSION：Sirt6 inhibits the acetylation of P53 protein to reduce its activity，counteracts ferroptosis-associated cell death and improves muscle mass by regulating the P53/SLC7A11/GPX4 signaling pathway.KEY WORDS sarcopenia；sirtuin 6；ferroptosis；deacetylation随着老龄化社会的到来，年龄相关的进行性骨骼肌变化引发的一系列负面影响越发突出。肌肉减少症（sarcopenia；简称肌少症）作为一种以骨骼肌质量降低、力量下降、功能退化为特征的全身性肌肉综合征，是衰老的特征性表现1-2。患病老年群体自主活动能力下降、术后并发症增加及住院时间延长3，给个人、家庭及社会带来巨大的心理压力和医疗经济负担。肌少症虽然已经被WHO定义为一种疾病，但对它的认识还远不清楚，值得我们进一步探索。氧化应激、炎症反应、肌蛋白合成与代谢失调等均被认为是肌少症发生的原因4-5。骨骼肌是机体质量最大的组织，通过有氧代谢维持生命活动，其铁元素含量丰富并随年龄增长不断累积6-8。这一特性让铁死亡（ferroptosis）这种铁依赖的、胞内脂质过氧化物和活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）急剧增加为特征的全新细胞死亡方式也参与到肌少症发生中9-11。铁死亡涉及多种基因信号表达变化，肿瘤抑制因子P53不仅参与肿瘤调控，近来也被发现在铁死亡诱导剂erastin（Era）作用后表达增强12，抑制下游胱氨酸/谷氨酸逆向转运系统（System XC）中的轻链亚基溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）表达和胱氨酸摄取，导致谷胱甘肽（glutathione，GSH）依赖的谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）活性降低，促进细胞膜上高表达的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，从而发生细胞铁死亡13-14。sirtuins是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依赖性脱乙酰酶，共有7个亚型。sirtuin 6（Sirt6）是位于细胞核中的多效赖氨酸脱乙酰酶，在能量代谢、衰老、炎症、应激反应和癌症等多方面发挥重要作用15-17。近期有研究发现Sirt6能够调控胃癌18和胰腺癌19中的铁死亡，但在肌少症领域中鲜有报道。使用生物信息学分析发现P53蛋白是肌少症和铁死亡交叉的关键信号之一。P53表达受多种翻译后修饰影响，在其C末端区域中多个赖氨酸位点受乙酰化作用调控并提高P53稳定性20。Sirt6通过使P53的C末端区域关键乙酰化位点第381位赖氨酸（Lys381）去乙酰化，降低P53活性，影响下游信号转导21。因此，本研究假设Sirt6通过去乙酰化作用降低 P53表达，经 P53/SLC7A11/GPX4信号通路抑制肌细胞铁死亡而改善骨骼肌质量，并进行实验验证。材料与方法1实验材料及主要试剂C2C12小鼠成肌细胞系购自中国科学院上海细胞库。C2C12专用培养液购自Procell；DMEM basic培养液和马血清均购自Gibco；铁死亡诱导剂Era、铁死亡特异性拮抗剂铁抑素1（ferrostatin-1，Fer-1）和Sirt6抑制剂 OSS-128167（OSS）均购自 MedChemExpress；Sirt6 激动剂 MDL-800（MDL）购自 APExBIO；CCK-8试剂及抗 Sirt6、肌肉环指蛋白 1（muscle ring-finger protein 1，MuRF1）、SLC7A11、GPX4 和 GAPDH 抗体均 购 自 ABclonal；抗 肌 球 蛋 白 重 链（myosin heavy chain，MHC）抗 体 购 自 Santa Cruz；抗 乙 酰 化 P53（Lys381）蛋白 Ac-P53（Lys381）抗体购自Immumoway；抗肌萎缩F盒蛋白（muscle atrophy F-box protein，MAFbx）抗体购自Proteintech；快速RNA提取试剂盒、Evo M-MLV反转录预混型试剂盒及SYBR Green PCR试剂盒均购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；抗P53抗体购自Cell Signaling Technology；DCFH-DA荧光探针购自Biosharp；GSH测定试剂盒购自上海碧