POU2F1调控miR-4...癌细胞增殖、迁移的实验研究_赵轶峰.pdf

调控 抑制胃癌细胞增殖、迁移的实验研究赵轶峰，李明霞，张 超，胡小敏，王 雄，赵铁军基金项目：河北省医学科学研究课题计划项目（）作者单位：河北 张家口，河北北方学院附属第一医院胃肠肿瘤外科作者简介：赵轶峰，本科，副主任医师。主要从事胃肠肿瘤外科方向研究 摘要 目的 探讨第 类 结构域转录因子（）调控 对胃癌细胞增殖、迁移能力的影响。方法 选取 年 月 年 月在河北北方学院附属第一医院收集的 例胃癌组织、癌旁组织和人胃黏膜上皮细胞 及人胃癌细胞株、为研究对象，采用 检测胃癌组织、癌旁组织和、细胞中、表达；采用蛋白印迹法检测胃癌组织、癌旁组织和、细胞中 蛋白表达；对 细胞进行转染，分为空白组（细胞未转染）、小干扰（）组（转染细胞）、组（阴性对照转染细胞）、组（转染细胞）、组（阴性对照转染细胞）、组（和 阴性对照共转染细胞）、组（和 共转染细胞），采用 法和 实验分别检测 细胞增殖、迁移能力；采用 和蛋白印迹法分别检测 细胞中、和 蛋白表达；采用双荧光素酶报告基因实验验证 与 启动子区结合情况。结果 与癌旁组织比较，胃癌组织 表达水平显著降低，和蛋白表达水平显著升高（）；与 细胞比较，、细胞 表达水平均降低，和蛋白表达水平均升高（），其中 细胞 表达水平最低，和蛋白表达水平最高。沉默 可抑制 细胞增殖、迁移，促进 表达；沉默 可促进 细胞增殖、迁移；沉默 可抑制 下调对 细胞增殖、迁移的作用效果，并可促进 表达。双荧光素酶报告基因实验证实 通过与 启动子区结合，发挥调控 表达的作用；沉默 可抑制 细胞的增殖与迁移能力，逆转下调 表达对 细胞增殖、迁移的影响。结论 可与 启动子区结合，沉默 可促进 表达进而抑制胃癌细胞的增殖与迁移。关键词 胃肿瘤；细胞增殖；细胞运动中国图书资料分类号 文献标志码 文章编号（），（，），（），（），（）（），（），（），（），（），临床误诊误治 23 年 2 月 第 36 卷 第 2 期 ,36,2 Februgary 23 （），（.），（.），；胃癌是世界范围内一种可致命的癌症，具有复发率高、转移快的特点。尽管胃癌的诊断和治疗取得一定进展，但是临床预后依然很差，年生存率仅为 。因此，深入了解胃癌进展的分子机制可以为改善其预后提供有价值的生物学标志物和潜在的治疗靶点。微小核糖核酸（）是一类由 个核苷酸组成的单链非编码，能够参与细胞增殖、凋亡、迁移和分化等许多生物过程。最近研究表明，位于 号染色体上的抑癌基因 通过靶向生长因子受体结合蛋白 抑制食管鳞状细胞癌的增殖和侵袭。然而，正如大多数文献报道，对于 的研究仅局限于靶基因的鉴定及对细胞生物学功能的影响方面，而关于其自身转录调控机制的研究却很少。本研究通过生物信息学预测发现第 类 结构域转录因子（）与 启动子区存在结合位点，作为 同源域家族的一员，已有研究显示其在肝癌组织中高表达，过表达促进了肝癌细胞增殖、集落形成、上皮间质转化、迁移和侵袭，而沉默 表达则抑制了这些恶性表型。但 调控 对胃癌细胞增殖、迁移的影响鲜有报道。因此，本研究旨在探索 对 表达的调控作用及对胃癌细胞增殖、迁移的影响，以期进一步阐明胃癌的发病机制。材料与方法.材料.胃癌组织样本及细胞：年 月年 月在河北北方学院附属第一医院共收集 例胃癌组织及与之匹配的癌旁组织（距癌组织 处）。其中男 例，女 例；年龄（）岁；期 例，期 例。将所有临床组织标本在液氮中速冻后保存于 冰箱中。所有临床组织标本的组织学诊断至少由 名病理专家证实。胃癌患者在手术或活检前均未接受任何抗肿瘤治疗。所有患者在本研究开始前签署本研究知情同意书。人胃黏膜上皮细胞株 和人胃癌细胞株、均购自上海信裕生物 科 技 有 限 公 司，批 号 分 别 为、。本研究获得医院医学伦理委员会批准。.主要试剂与仪器：小干扰（）、阴 性 对 照、阴性对照及、引物均由上海基屹生物科技有限公司设计合成；培养基（批号）、试 剂（批 号 ）、裂 解 液（批 号）、转染试剂盒（批号）、四甲基偶氮唑蓝（，批号）均购自上海创凌生物科技有限公司；胎牛血清（，批号）、羊抗鼠二抗（批号）、化学发光试剂盒（批号）均购自北京威瑞谷生物技术有限公司；鼠源（批号）、单克隆抗体（批号）、双荧光素酶报告基因检测试剂盒（批号）均购自常州福生生物技术有限公司；培养箱（型号 ）、酶标仪（型号）、凝胶成像仪（型号 ）均临床误诊误治 23 年 2 月 第 36 卷 第 2 期 ,36,2 Februgary 23购自北京博劢行仪器有限公司；仪（型号）、小室（型号）均购自北京明阳科华科技有限责任公司。.研究方法.细胞培养：将人胃黏膜上皮细胞株 及人 胃 癌 细 胞 株、在培养基中培养，该培养基含有 、链霉素 和青霉素 ，置于含有 的 培养箱中。取对数生长期细胞用于后续实验。.检 测 胃 癌 组 织、癌 旁 组 织 和、细胞中、表达：将胃癌组织和癌旁组织匀浆，使用 试剂从胃癌组织、癌旁组织和、细胞中提取总。使用 分光光度计测定 浓度后，将 反转录为。在 系统上使用 进行 扩增。引物序列：上游引物：，下游引物：；上游引物：，下 游引物：；上游引物：，下游引物：。以 作为内参，通过 法分析、的相对表达。每种细胞设置 个重复组。.蛋白印迹法检测胃癌组织、癌旁组织和、细 胞 中 蛋白表达：将胃癌组织和癌旁组织匀浆，利用 裂解液提取胃癌组织、癌旁组织和、细胞中蛋白质，定量蛋白浓度后，通过电泳分离等量蛋白质。电泳结束后，将蛋白质转移至聚偏氟乙烯膜上，然后用 脱脂牛奶封闭膜 ，用 洗膜 次，再将膜分别与鼠源（）、（）一抗在 下孵育过夜。第 日用 洗膜 次后，将膜与羊抗鼠二抗（）于室温下孵育 ，化学发光试剂盒可视化蛋白，采用 软件对灰度值进行量化分析（内参为）。每种细胞设置 个重复组。.细胞转染与分组：取对数生长期 细胞，利用 转染试剂盒进行转染，分为空白组（细胞未转染）、组（转 染 细 胞）、组（阴性对照转染细胞）、组（转染细胞）、组（阴性对照转染细胞）、组（和 阴性 对 照 共 转 染 细 胞）、组（和 共转染细胞）。每组设置 个复孔。.法检测 细胞增殖能力：将“.”中转染后培养 的各组 细胞以 个 孔的密度接种在 孔板上，向每孔中加入 ，于、条件下培养，然后向每孔中加入二甲基亚砜 ，使用酶标仪测定 波 长 处 的 光 密 度（）值，计 算细胞增殖率，增殖率 各转染组 值 空白组 值。.实验检测 细胞迁移能力：将“”中转染后的各组 细胞加入到无 的 培养基重悬后，调整细胞浓度为 个，取 转移至 上室中，并使用 含有 的 培养基填充于 下室中。后，细胞用 多聚甲醛固定 ，结晶紫染色 ，显微镜下随机选取 个视野计数迁移细胞数目。.和蛋白印迹法检测 细胞中、和 蛋 白 表 达：将“.”中转染后培养 的各组 细胞，按照“”和“”中的方法检测 细胞中、和蛋白表达。.双荧光素酶报告基因实验：使用 在线软件预测 与 启动子区的结合位点，分别构建 启动子区野生型（）和突变型（）报告质粒，标记为、。按 照 转染试剂盒说明书将 和 分别与 阴性对照或 共转染于 细胞，分别记 为：组（阴性对照和 共转染）、组（和 共转染）、组（阴性对照和 共转染）、组（和 共转染）。每组设置 个复孔，转染 后，使用双临床误诊误治 23 年 2 月 第 36 卷 第 2 期 ,36,2 Februgary 23荧光素酶报告基因分析系统评估荧光素酶相对活性。.统计学方法 应用 软件分析数据，计量资料以均数 标准差（）表示，组间比较采用 检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用 检验。为检验水准。结果.胃癌组织、癌旁组织中 及、蛋白表达比较与癌旁组织比较，胃癌组织 表达水平显著降低，和蛋白表达水平显著升高（），见表。.、细胞中 及 、蛋白表达比较与 细胞比较，、细胞 表达水平均降低，和蛋白表达水平均升高（），其中 细胞 表达水平最低，和蛋白表达水平最高。见表。因此选用 细胞为研究对象进行后续研究。.沉默 对 细胞增殖、迁移及、和 蛋白表达的影响 与空白组和 组比较，组 细胞增殖率、迁移细胞数目、和 蛋白表达水平显著降低，表达水平显著升高（）；空白组和 组上述指标比较差异无统计学意义（.）。见表。.沉默 逆转下调 表达对 细胞增殖、迁移及、和 蛋白表达的影响与空白组和 组比较，组和 组细胞增殖率、迁移细胞数目显著升高（.），表达水平显著降低（），和蛋白表达水平差异无统计学意义（.）；与 组和 组 比 较，组 细胞增殖率、迁移细胞数目、和 蛋白表达水平显著降低，表达水平显著升高（.）。见表。表 胃癌组织、癌旁组织中 及 、蛋白表达比较（）组织例数 蛋白胃癌组织 癌旁组织 注：为第 类 结构域转录因子；与癌旁组织比较，表 、细胞中 及 、蛋白表达比较（）细胞例数 蛋白 细胞 细胞 细胞 细胞 注：为第 类 结构域转录因子；与 细胞比较，表 沉默 对 细胞增殖、迁移及、和 蛋白表达的影响（）组别例数细胞增殖率（）迁移细胞数目（个）蛋白空白组 组 组 注：为第 类 结构域转录因子；与空白组比较，；与 组比较，临床误诊误治 23 年 2 月 第 36 卷 第 2 期 ,36,2 Februgary 23表 沉默 逆转下调 表达对 细胞增殖、迁移及、和 蛋白表达的影响（）组别例数细胞增殖率（）迁移细胞数目（个）蛋白空白组 组 组 阴性共转染组 共转染组 注：为第 类 结构域转录因子；与空白组比较，；与 组比较，；与 组比较，；与阴性共转染组比较，；阴性共转染组为 和 阴性对照共转染，共转染组为 和 共转染.生物信息学预测 上游转录因子使用 预测发现 与 启动子区存在结合位点，结合位点位于 号染色体上的 区域，结合序列为。双荧光素酶报告基因实验结果表明，组、组、组及 组荧光素酶相对活性分别为 、.，与 组比较，组荧光素酶相对活性显著升高（.）；组和 组荧光素酶相对活性比较差异无统计学意义（.）。讨论 胃癌是癌症相关死亡的第三大原因，也是全球第五大癌症。相关数据统计，东亚地区胃癌发病率急剧升高，该地区男女发病率在全球范围内最高。由于缺乏特异性生物学标志物，大多数新诊断的胃癌患者在确诊时已处于晚期。因此，迫切需要进一步研究胃癌的发病机制并确定与胃癌相关的特异性标志物。在肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、迁移和侵袭中发挥重要作用。李燕等发现 在宫颈癌细胞中低表达，过表达可抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移及侵袭。万智双等表明 可通过下调丝裂原活化蛋白激酶 表达抑制肝癌细胞 的迁移和侵袭。杨艳等阐明下调 可促进结直肠癌 细胞增殖、迁移、侵袭。等报道 通过靶向环磷酸腺苷反应元件结合蛋白来抑制神经胶质瘤细胞的生长、侵袭及迁移。本研究结果显示，在 胃 癌 组 织 和 胃 癌 细 胞、中呈低表达状态，且 在 细胞中的表达水平最低，因此本研究选择 细胞进行转染实验。本研究还发现，抑制 表达可明显促进 细胞的增殖和迁移，提示 在胃癌中发挥着抑癌基因的作用。但关于 上游的调控机制尚不清楚，据报道转录因子可正向或负向调节 的表达，因此本研究通过使用 .预测发现转录因子 与 启动子区存在结合位点。也称为八聚体结合转录因子，由染色体.上的基因位点编码。它是一种普遍存在的转录因子，可调节与细胞周期相关靶基因的表达。相关文献报道，通过脂肪非典型钙黏蛋白 信号通路促进肝细胞癌的生长和转移，可作为肝癌治疗的靶点。敲低 表达可导致头颈部鳞状细胞癌细胞的增殖和侵袭数目显著减少。在肺癌细胞中高表达，且具有促进肺癌细胞上皮间充质转化、迁移侵袭、增殖及克隆形成等生物学功能。在胃癌患者中上调并且与较 差 的 存 活 率 显 著 相 关。有 研 究 报 道 可与 的启动子序列互补结合调节 在胃癌中的表达。但 与 在胃癌中的调控关系尚不十分清楚。本研究结果显示，和蛋白在胃癌组织和细胞中高表达，双荧光素酶报告基因实验证实 作为转录因子，通过与 启动子区结合，发挥调控 表达的作用；沉默 可抑制 细胞的增殖与迁移能力，促进 表达，下调 表达对临床误诊误治 23 年 2 月 第 36 卷 第 2