3-3’二吲哚甲烷对放射性...损伤的防护作用及其机制研究_杨百霞.pdf

交通医学2022年第36卷第6期Med J of Communications,2022,Vol.36,No.6文章编号1006-2440（2022）06-0554-04引文格式杨百霞，谢国栋，倪峰，等.3-3 二吲哚甲烷对放射性肺损伤的防护作用及其机制研究 J.交通医学，2022，36（6）：554-557.放射性肺损伤（radiation-induced lung injury，RILI）是胸部肿瘤放疗最常见的并发症之一，病变周围的肺组织因接受超过阈值的放射剂量，产生不可逆性损伤1。目前精确放疗技术不断改进，大大降低了辐射剂量和体积，但仍有 30%以上患者发生 RILI。RILI 在肺癌放疗中的发病率最高（5%25%），其次是纵隔淋巴瘤（5%10%）和乳腺癌（1%5%）2。RILI病理变化包括放射性肺炎和放射性肺纤维化两个阶段，是动态的连续过程3-4。目前 RILI 发生机制尚不明确，是由多种细胞因子参与，涉及细胞损伤、氧化应激、基因改变等复杂过程。寻找放射性肺损伤的防护药物是临床上亟待解决的问题。*基金项目 南通市卫生健康委员会科研立项课题（MB2019019）。*作者简介 杨百霞，女，汉族，陕西西安人，生于 1980 年 12 月，硕士研究生，主治医师。研究方向：肿瘤放射治疗学。通信作者：葛琴，E-mail：3-3二吲哚甲烷对放射性肺损伤的防护作用及其机制研究*杨百霞*，谢国栋，倪峰，崔晓佳，葛琴（南通大学附属肿瘤医院/南通市肿瘤医院放疗科，江苏226361）摘要目的：探讨 3-3 二吲哚甲烷（DIM）对小鼠放射性肺损伤的防护作用及其作用机制。方法：120 只雌性C57BL/6 小鼠，随机分为空白对照组、单纯照射组（一次性全胸照射 16 Gy）、单纯 DIM 组（仅灌胃 DIM 75 mg/kg）、照射+DIM 组（照射前 30 min 灌胃 DIM 75 mg/kg）、照射+泼尼松组（照射前 30 min 灌胃泼尼松 5 mg/kg）。于照射后 24 小时、1 周、2 周、4 周处死小鼠，取小鼠肺组织标本切片，HE 染色后显微镜下进行病理学评分，Western blot 检测肺组织TGF-1、VEGF 蛋白表达。结果：与单纯照射组比较，照射+DIM 组小鼠肺损伤程度明显减轻，肺组织 TGF-1 及VEGF 蛋白表达水平明显降低。结论：3-3 二吲哚甲烷对小鼠放射性肺损伤有明显的辐射防护作用，其机制可能与TGF-1/VEGF 通路有关。关键词3-3 二吲哚甲烷；放射性肺损伤；辐射防护；TGF-1/VEGF 通路中图分类号R730.55文献标志码ADOI10.19767/ki.32-1412.2022.06.002Study on the protective effect and mechanism of 3-3diindolylmethaneon radiation-induced lung injuryYANG Baixia,XIE Guodong,NI Feng,CUI Xiaojia，GE Qin(Department of Radiotherapy,Affiliated Tumor Hospital of Nantong University/Nantong Tumor Hospital,Jiangsu 226361)AbstractObjective:To investigate the protective effect and mechanism of 3-3diindolylmethane(DIM)on radia-tion-induced lung injury in mice.Methods:120 female C57BL/6 mice were randomly divided into blank group,simpleirradiation group(16 Gy of total chest irradiation),simple DIM group(75 mg/kg of DIM by gavage),irradiation+DIM group(75 mg/kg of DIM by gavage 30 minutes before irradiation)and irradiation+prednisone group(5 mg/kg of prednisone bygavage 30 minutes before irradiation).The mice were killed at 24 hours,1 week,2 weeks and 4 weeks after irradiation.Thelung tissue samples of the mice were sectioned.After HE staining,the pathological score was performed under the micro-scope,TGF-1 and VEGF protein expression in the lung tissue was detected by Western blot.Results:Compared with thesimple irradiation group,the degree of lung injury in the irradiation+DIM group was significantly reduced,and the lung tis-sue TGF-1 and VEGF protein expression level decreased significantly.Conclusion:3-3diindolemethane has obviousradiation protective effect on radiation lung injury in mice.Its mechanism may be related to TGF-1/VEGF pathway.Key words3-3diindolylmethane;radiation lung injury;radiation protection;TGF-1/VEGF pathway554交通医学2022年第36卷第6期Med J of Communications,2022,Vol.36,No.63-3 二吲哚甲烷（diindolylmethane，DIM）是吲哚-3-甲醇（indole-3-carbinol，I3C）衍生物，为小分子化合物，人体口服吸收顺利，耐受性良好，无明显毒副作用5。I3C 及 DIM 可以正向调节电离辐射导致的 DNA 损伤、修复密切相关蛋白 ATM 及 BRCA1 表达及其磷酸化6。DIM 通过 ATM/BRCA1 磷酸化激活，选择性增加正常组织耐辐射能力，延长受照动物的存活时间，而不影响肿瘤组织的放射治疗敏感性7。本研究通过建立放射性肺损伤小鼠模型8-11，探讨 DIM 对放射性肺损伤的防护作用及其作用机制。1材料与方法1.1材料与试剂120 只清洁级雌性 C57BL/6 小鼠，体重 202 g（无锡江南实验动物中心），自由进食进水，常温下适应性喂养 3 d 后用于实验。DIM（纯度99%，江苏普乐司生物科技有限公司），EDTA 抗原修复液、抗转化生长因子-1（transforming growthfactor-1，TGF-1）一抗（1100，英国 Abcam 公司），BSA（Sigma），二抗：HRP 标记山羊抗兔（1200，KPL公司），抗血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）一抗（1100，Santa Cruz 公司）；二抗：HRP 标记的山羊抗兔鼠（即用型，丹麦DAKO 公司）。Synergy 直线加速器（瑞典 ELEK-TA公司），正置光学显微镜（E100）、成像系统（DS-U3）（日本尼康公司），凝胶成像系统（美国 Bio-Rad 公司）。1.2方法1.2.1动物模型构建：将 120 只 C57BL/6 小鼠随机分为空白对照组、单纯照射组、单纯 DIM 组、照射+DIM 组、照射+泼尼松组，每组 24 只。10%水合氯醛麻醉小鼠后，单纯照射组、照射+DIM 组、照射+泼尼松组小鼠采用加速器 6MV-X 射线单次全胸照射，剂量 16 Gy。照射+DIM 组于照射前 30 min 灌胃DIM 75 mg/kg12，照射+泼尼松组于照射前 30 min 灌胃泼尼松 5 mg/kg；单纯 DIM 组仅灌胃 DIM 75 mg/kg，空白对照组给予同等容量生理盐水灌胃。小鼠经单次 16 Gy X 射线全胸照射后无死亡。照射后于 24 h、1 周、2 周、4 周颈椎脱臼法处死小鼠，每次每组处死6 只小鼠。将肺组织以 10%甲醛液固定，常规取材、石蜡包埋、切片，HE 染色，于显微镜下进行观察。与空白对照组小鼠比较，主要表现为肺泡壁充血，有炎细胞浸润，与文献报道基本一致，表明模型建立成功。1.2.2肺组织病理学评分：根据肺组织病变（肺泡壁充血、出血、炎细胞浸润及肺气肿）程度评分：基本正常为 0 分，轻微或极少量计 0.5 分，轻度或少量计 1分，中度或较多计 2 分，重度或多量计 3 分，极重度或大量计 4 分。根据病变区域占整个制片区域的比例评分，基本正常计 0 分，局部病变（12%）计 0.5分，小范围病变（12%25%）计 1 分，中等范围病变（25%50%）计 2 分，大范围病变（50%75%）计 3分，广泛病变（75%）计 4 分。累加所有分数，取平均分，分值越高提示损伤程度越严重。1.2.3Western blot 检测蛋白表达：取照射后 2 周的小鼠肺组织，剪碎，RIPA 裂解液提取蛋白，BCA 试剂盒进行蛋白定量。用 10%SDS-PAGE 分离蛋白，转移蛋白至 PVDF 膜。5%BSA 室温封闭 2 h，加入一抗，4 封闭过夜。次日洗去一抗（TGF-1，11 000；VEGF，11 200），加入二抗室温封闭 1 h，将膜洗净，滴加化学发光液，凝胶成像系统获取蛋白条带图片，Image J 软件对条带灰度值定量分析。1.3统计学处理应用 SPSS 19.0 统计软件进行数据处理分析。计量资料以x?s 表示，组间差异性比较采用 One-Way ANOVA 检验。P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1各组小鼠放射性肺损伤病变程度比较照射后各时间点各组病变程度比较，差异均有统计学意义（P0.05），单纯照射组病变最明显，其次是照射+泼尼松组，照射+DIM 组病变程度最轻，照射后 2 周放射性肺损伤反应最明显。见表 1、见图 1。2.2各组肺组织TGF-1、VEGF蛋白表达水平比较单纯照射组小鼠肺组织 TGF-1、VEGF 蛋白表表1各组小鼠放射性肺损伤评分比较分组别照射后24 h照射后1 周照射后2 周照射后4 周空白对照组3.00.93.20.23.50.33.60.1单纯照射组5.21.15.50.45.90.25.60.5单纯 DIM 组4.30.24.40.54.20.64.30.3照射+DIM 组4.70.44.90.45.10.44.80.4照射+泼尼松组5.00.25.20.55.40.25.40.1P 值0.010.0010.0010.001555交通医学2022年第36卷第6期Med J of Communications,2022,Vol.36,No.6图1各组小鼠放射性肺损伤肺组织切片观察（照射后2w）达水平高于空白对照组，差异有统计学意义（P0.05）；照射+DIM 组小鼠 TGF-1、VEGF 蛋白表达水平低于单纯照射组，差异有统计学意义（P0.05）；见图 2、图 3。照射+泼尼松组小鼠 TGF-1、VEGF 蛋白表达水平低于单纯照射组，差异有统计学意义（P0.05）。3讨论放射治疗是治疗胸部恶性肿瘤的重要手段之