PEDV_nsp15基因真...表达载体的构建及蛋白的表达_张宁.pdf

黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报第 35 卷收稿日期：2021-04-28基金项目：黑龙江八一农垦大学博士科研启动基金（XDB2015-18）。作者简介：张宁（1997-），女，黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院 2019 级硕士研究生。通信作者：肖莉杰，女，副教授，硕士研究生导师，E-mail：。PEDV nsp15 基因真核表达载体的构建及蛋白的表达张宁1，郑亮1，2，杨超玥1，吴志军1，张华1，曹宏伟1，肖莉杰1（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院）摘要：猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）含有一种名为 Nsp15 的非结构蛋白，为了研究 Nsp15 蛋白在侵染宿主细胞时产生的作用，成功构建了 PEDV Nsp15 基因的真核表达载体。通过 PCR 技术扩增 Nsp15 基因片段，经双酶切连接到 pCMV-Myc 载体上，酶切鉴定及测序结果证实 PEDV Nsp15 基因成功克隆到 pCMV-Myc 载体中，并将重组质粒命名为 pCMV-Myc-Nsp15。将重组质粒 pCMV-Myc-Nsp15 转染至 IPEC-J2 细胞中，利用 Western Blot 和间接免疫荧光技术检测pCMV-Myc-Nsp15 的表达以及定位情况。结果显示，pCMV-Myc-Nsp15 在 IPEC-J2 细胞中成功表达，并且在胞质胞核均匀分布。为进一步研究 PEDV Nsp15 蛋白的功能奠定基础。关键词：猪流行性腹泻病毒；真核表达载体；非结构蛋白 15中图分类号：S858.26；Q786文献标识码：A文章编号：1002-2090（2023）01-0072-06Construction of Eukaryotic Expression Vector and Protein Expression of PEDV Nsp15 GeneZhang Ning1，Zheng Liang1，2，Yang Chaoyue1，Wu Zhijun1，Zhang Hua1，Cao Hongwei1，Xiao Lijie1（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University）Abstract：Porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）contains a nonstructural protein called Nsp15.In order to study the role of Nsp15protein in the infection of host cells，the eukaryotic expression vector of PEDV Nsp15 gene was constructed.Nsp15 gene fragment wasamplified by PCR，and was linked to pCMV-myc vector by double enzyme digestion.The results of enzyme digestion identificationand sequencing confirmed that PEDV Nsp15 gene was cloned into pCMV-Myc vector，and the recombinant plasmid was namedpCMV-Myc-Nsp15.The recombinant plasmid pCM-Myc-Nsp15 was transfected into IPEC-J2，and the expression and localization ofpCM-Myc-Nsp15 were detected by Western Blot and immunofluorescence.The results showed that pCMV-Myc-Nsp15 wasexpressed in IPEC-J2 cells and uniformly distributed in the cytoplasm and nucleus.Key words：PEDV；eukaryotic expression vector；Nsp15猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrheavirus，PEDV）引发的一种猪病毒性疾病且具有传染性，这种疾病主要是对猪的肠道产生损伤。一旦猪感染此病毒，大多数的猪就会产生腹泻、呕吐、脱水、体重减轻等症状1-2。不论哪个年龄段的猪均可感染此病，感染 PED 的临床症状依赖于猪的年龄，一但处于哺乳期的仔猪感染此病毒后，致死率高达 100%3-4。PED 首次在英国爆发。2010 年 10 月，PED 在南方的多个省份暴发后，该病在中国才开始出现大规模的流行，并迅速席卷全国，由于其高致死率导致养猪行业遭受沉重打击5-6。PEDV 属于 冠状病毒，为正链的单股 RNA 病毒7。该病毒的全基因组长度为 28 kd。主要包括 5 和3 非翻译区，3 端含有 poly（A）尾结构。PEDV 病毒共编码了 21 个蛋白，这 21 种蛋白主要可以分别为 M蛋白即膜蛋白、E 蛋白即囊膜蛋白、N 蛋白即核衣壳蛋白、S 蛋白即纤突蛋白还有辅助蛋白 ORF3 蛋白与doi:10.3969/j.issn.1002-2090.2023.01.012第 35 卷第 1 期2023 年2 月黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报Journal of Heilongjiang Bayi Agricultural University35（1）：7277Feb.2023第 1 期16 个非结构蛋白，分别为 Nsp1 蛋白、Nsp2 蛋白-Nsp14 蛋白、Nsp15 蛋白、Nsp16（nonstructural protein）。它们一起参与调控病毒基因组 mRNA 的合成以及病毒的复制8-11。在 PEDV 全基因组中，Nsp15 蛋白为病毒的非结构蛋白，蛋白是一个 339 残基多肽，由 pp1ab 在6139NLQGLE6144 和 6478QLQASE6483 位点被主蛋白酶 Nsp5 裂解而成12。Nsp15 蛋白拥有内切核糖核酸酶活性（Nendo U），在不同种冠状病毒中氨基酸序列保守性较高。病毒复制转录酶复合体是冠状病毒编码 Nsp15 蛋白的重要组成部分，其在病毒复制和转录中必不可少。现阶段研究发现，SARS-CoV Nsp15 蛋白逃避天然免疫可通过抑制细胞凋亡的机制13；MHV A59Nsp15 蛋白的内切酶活性能有效地阻止宿主巨噬细胞 dsRNA 受体的激活，进一步证实了 Nsp15 蛋白通过复制酶复合物将早期 dSRNA 共定位在复合体中或者直接将其切割降解，从而躲避宿主细胞 RLRS 的识别，最终抑制 RNA 降解和细胞凋亡14；PEDVnsp15 作为一种关键的毒力因子，在体外抑制 IFN 反应，促进 PEDV 复制，但其潜在机制尚不清楚15。目前，关于冠状病毒 Nsp15 研究的机制内容较少，PEDV nsp15 蛋白亦是如此。蛋白重组质粒的成功构建与表达可为研究关于 PEDV Nsp15 蛋白的生物学功能起到铺垫作用。在研究中，首先通过用 PCR基因扩增的方法扩增出研究所需要的 PEDV Nsp15基因，并将得到的目的基因片段 PEDV Nsp15 与真核表达载体相连接。构建成重组表达载体，并命名为pCMV-Myc-Nsp15。将重组表达载体 pCMV-Myc-Nsp15 转染 IPEC-J2 细胞，用免疫印迹技术（WesternBlot）与间接免疫荧光实验去检测重组质粒 pCMV-Myc-Nsp15 在细胞内的表达情况及亚细胞定位情况。Western Blot 结果显示，pCMV-Myc-Nsp15 重组表达蛋白大小表达正确；间接免疫荧光技术结果显示，重组表达载体 pCMV-Myc-Nsp15 分布于 IPEC-J2 细胞胞质及胞核。结果说明，PEDV Nsp15 基因的重组表达载体成功被构建，并且重组表达载体pCMV-Myc-Nsp15 在 IPEC-J2 细胞中成功表达，为以后研究 PEDV Nsp15 蛋白的功能以及特性奠定了一定的基础。1材料与方法1.1 材料IPEC-J2 细胞由实验室于-80 冻存复苏；PEDV Nsp15 基因由浙江大学黄耀伟教授馈赠；小鼠抗 Myc 单克隆抗体（mAb）购自北京中衫金桥生物技术公司；DEME 培养基和胎牛血清（fetal cattle serum，FBS）、LipofectamineTM2000购自 Invitrogen 公司；DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购于 Omega 公司；MLV 逆转录酶，PCR 试剂盒、限制性内切酶、T4 连接酶、M-MLV 反转录酶、ExTaq 热启动 DNA 聚合酶购自 TaKaRa 公司；目的基因的特异性引物合成及重组质粒的序列测定均由擎科（北京）公司完成；感受态细胞 DH5、pCMV-Myc 载体由实验室保存。1.2 引物设计及表达载体构建路线按照已经发表在 GenBank 网站中的猪流行性腹泻病毒的毒株基因序列报道为根据，利用 primer 5软件设计出具有特异性的 Nsp15 基因上游和下游引物，特异性上游引物：5-CCGGAATTCGGGGTCTTG-AGAACATTGCTTTCAATG-3（包含 EcoR I 酶切位点）和特异性下游引物，5-ATAAGAATGCGGCCGCCTGAAGTTGCGGATAAAATGTCTGG-3（包含 Not I酶切位点）。将 PEDV Nsp15 基因插入 pCMV-Myc 的EcoR I/Not I 位点之间。构建以 pCMV-Myc 为载体的PEDV Nsp15 蛋白融合表达载体。1.3 扩增 PEDV Nsp15 基因将 RNA 用液氮进行研磨，将混合液放于 EP 管中，剧烈摇晃 1 min 后静止 10 min，加入冰冷的三氯甲烷试剂，快速摇晃 20 s，静止 15 min 后。在转速为12 000 r min-1，4 离心机中离心 15 min。离心停止后，取离心管中的上层澄清液于新的 1.5 ml EP 管内，将异丙醇 600 L 加入装有上述澄清液的 EP 管中，轻轻摇晃 15 S，让两者混匀，静止时间为 10 min，随后放置离心机内，离心 10 min，转速为 12 000 r min-1。将上清液丢弃，在加入 75%的乙醇 600 L，静止10 min。去上清，吹干剩余液体，加入 20 L 的 DEPC水溶解，静止 10 min，在-80 冰箱中保存。研究过程中所用的耗材需要提前用 DEPC 水处理，4 离心机需提前遇冷。RNA 提取完毕后，加入 Random Primer 1 L、Specific Primer 2 L、DEPC 水 2 L；反应条件为 70 保温 10 min。在向上述管中加入以下试剂混合液，5M-MLV buffer 2 L、dNTP mix（10 mM）0.5 L、M-MLV 1 L、DEPC 水 1 L，总反应体系 10 L；反应过程为 30 保温 10 min，42 保温 60 min，70 保温 15 min。以此得到的 cDNA 为模板，加入上游引物张宁等：PEDV nsp15 基因真核表达载体的构建及蛋白的表达73黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报第 35 卷0.2 L，下