基于Aβ42转基因果蝇对红参多糖防治阿尔茨海默病作用及机制的研究.pdf

基金项目：国家自然科学基金项目（）；国家重点研发计划中医药现代化研究重点专项（）作者简介：白玉莹（），女，硕士生研究生在读，研究方向：中药炮制及质量控制研究，：通信作者：李向日（），女，博士，教授，研究方向：中药炮制及质量控制研究，：基于 转基因果蝇对红参多糖防治阿尔茨海默病作用及机制的研究白玉莹徐新房张姝妍程水清王璇文佳李春帅徐文娟杨琳琳李向日（北京中医药大学中药炮制研究中心 中药品质评价北京重点实验室，北京，）摘要目的：观察红参多糖对 淀粉样蛋白（）转基因果蝇阿尔茨海默病模型行为学的影响，并检测果蝇脑组织 淀粉样蛋白 （）、超氧化物歧化酶（）、丙二醛（）、环腺苷酸（）及乙酰胆碱酯酶（）水平，评价红参多糖对阿尔茨海默病的治疗作用并探讨其可能的作用机制。方法：正常野生型果蝇作为空白组，转基因果蝇随机分为 组，即模型组、红参多糖组、盐酸多奈哌齐阳性对照组。后比较果蝇的攀附指数、进入无障碍可食离心管果蝇的个数以及果蝇脑组织中 、及 含量。结果：攀附指数显示红参多糖组、阳性对照组均极显著高于模型组，差异均有统计学意义（均 ），且红参多糖组与阳性对照组比较，差异无统计学意义（）；在各时段内，红参多糖组、阳性对照组进入无障碍可食离心管果蝇个数均显著高于模型组，差异有统计学意义（或 ）。红参多糖组、阳性对照组果蝇 活性均显著高于模型组，差异均有统计学意义（均 ），红参多糖组、阳性对照组果蝇 、含量均显著低于模型组，差异均有统计学意义（均 ），且红参多糖组与阳性对照组比较，差异无统计学意义（）。结论：红参多糖可提高果蝇脑组织中 活性、降低其 、及 水平，推测红参多糖可能是通过改善 沉积、抗氧化和改善神经细胞信号转导等方面，对 转基因果蝇起到较好的治疗作用，且其效果与阳性对照药相当。关键词红参多糖；阿尔茨海默病；转基因果蝇；行为学；抗氧化；认知障碍 ，（，）：（），（），（），（），（），：（），（），：（），（），（），（），（）：，；中图分类号：；文献标识码：，阿尔茨海默病（，），又称老年性痴呆，是一种常见的神经退行性疾病，其临床表现主要为记忆缺失和认知功能障碍，组织学上的特征是神经元丢失、蛋白过度磷酸化导致的神经原纤维缠结和细胞外淀粉样斑块。随着病情的加剧，逐渐影响 患者生命质量，初期只是忘记一些小事，后期则是丧失生活能力，基本的生活均依赖护理人员，给家属带来极大的负担。患者寿命也有所缩短，危害性极大 。迄今为止，有效治疗药物较少。现有的抗 药物仅能改善病理症状，但不能有效阻止、逆转病情，并且停药后极易复发。中医治疗痴呆历史悠久，痴呆病名首见于汉代 华佗神医秘传，主要病机为神机失用，脑髓空虚，气血不足，导致心神失养。本病多表现为本虚标实，以心肝脾肾虚为本，痰瘀内生、气血逆乱为标 。治疗以补益气血元阴为主，兼以祛痰、活血化瘀等。人参为五加科植物人参 的栽培品，于秋季采挖，洗净，蒸制后，干燥而得的根和根茎。鲜人参经蒸制后得到红参，中华人民共和国药典（版）中记载其味甘、微苦，温。归脾、肺、心、肾经。具有大补元气、复脉固脱、益气摄血的作用 。红参味甘而厚，性偏温，其药性与 的证候相对应。因此，在临床上，红参广泛用于 的治疗。果蝇寿命短，繁殖力强，其代谢、生理状况和生长发育同哺乳动物基本相似，是研究寿命及抗衰老药物的理想模型。因此，常被用来研究人神经退行性疾病 。果蝇成虫大脑有着复杂的神经回路和神经纤维网，可调节各种行为，如飞行、打斗、梳理、觅食、学习和记忆、睡觉和昼夜节律等。因此，许多作用于哺乳动物中枢神经系统的药物被证实能在果蝇的大脑内发挥同样的作用 。人和果蝇在基因和代谢水平上也都存在着极大的相似性 。红参多糖是红参中主要活性成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗衰老、提高免疫力等作用 ，然而关于红参多糖治疗 的研究较少。故本实验以转基因 果蝇为模型，通过果蝇攀爬能力实验，果蝇嗅觉记忆实验，测定果蝇脑组织 淀粉样蛋白 （，）、超氧化物歧化酶（，）、丙二醛（，）、环腺苷酸（，）及乙酰胆碱酯酶（，）水平，探究红参多糖对 的治疗作用机制，进一步拓宽红参多糖的药用途径，为相关研究提供参考依据。材料与方法 材料 动物野生型（）黑腹果蝇（）、转基因果蝇，均由北京师范大学孙林教授惠赠。对果蝇生活环境实行每天 明暗光照周期处理，温度（），相对湿度 。药物人参药材（）于吉林（南岭参场）收集，经北京中医药大学李向日教授鉴定为五加科植物人参 的根及根茎。红参多糖：根据课题组前期建立的红参炮制专利方法对人参原药材进行炮制得到红参药材，将所得到的红参药材按实验室前期研究的提取方法制得红参多糖。盐酸多奈哌齐（上海源叶生物有限公司，批号：）。试剂与仪器苯甲酸（北京化工厂，货号：）；丙酸（天津福晨化学试剂有限公司，货号：）；蔗糖（天津福晨化学试剂有限公司，货号：）；琼脂（北京奥博星生物技术有限责任公司，货号：）；总蛋白（，）试剂盒（货号：）、试剂盒（货号：）、试剂盒（货号：）、试剂盒（货号：）、试剂盒（货号：）、试 剂 盒（货 号：）均购于北京瑞格博科技发展有限公司。全自动生化分析仪（贝克曼库尔特有限公司，美国，型号：）；酶标仪（赛默飞世尔科技有限公司，芬兰，型号：）。方法 分组与模型制备 内孵化出的幼虫不会交配，在 内把雌雄果蝇分开培养，所得的果蝇即为处女蝇。每天晚上 ：将培养瓶内的成蝇转移，次日早晨 ：对新羽化的果蝇进行挑选，在二氧化碳麻醉板上收集 内羽化的雄性处女蝇，将其移入装有新鲜培养基的玻璃指管内，每个玻璃指管按照实验需求装入果蝇 或 只，并标明日龄。每天更换次培养基。共分为组：野生组，即正常 型处女蝇；转基因处女蝇随机分为模型组、阳性对照组和红参多糖组组。连续喂养 ，每 天更换 次培养基。给药方法基础培养基的制备：玉米粉 、琼脂 、蔗糖 ，以上材料倒入 蒸馏水中，不断搅拌并加热，煮沸后 ，停火，放凉世界中医药 年 月第 卷第 期至 左右，加入 苯甲酸 、丙酸 ，持续搅拌，冷却至 后，加入酵母粉 ，混匀后，倒入高 、直径 经高温灭菌的指管中，培养基厚度约 。培养基需要倒置于干燥实验室内 以上。经过摸索确定最佳给药剂量，在基础培养基中分别加入实验室自制的红参多糖和盐酸多奈哌齐（阳性对照药物），制成浓度为 红参多糖和 盐酸多奈哌齐培养基。检测指标与方法 果蝇攀爬能力实验果蝇攀爬能力实验是利用果蝇的反趋地性，通过观察果蝇在垂直的指管内的爬行情况来测试果蝇的运动能力。将以上 组待测果蝇分别装入未装培养基的空指管中，果蝇于空指管内适应 ，轻晃指管将果蝇摇至瓶底，果蝇由于习性将向上爬。测试 到达指管顶部的果蝇个数（），至少连续记录 次，每次至少间隔 ，每次晃动的力度一致。计算攀附指数（，）即 总数。记录 次，取平均值。越高，证明果蝇的运动能力越强。测试时，每管内随机放置果蝇 只，每个组别各测试 管，每组共计 只，组共计 只（正常 型处女蝇 只，转基因处女蝇随机分为模型组、阳性对照组和红参多糖组共 只，雌雄各半）。果蝇嗅觉记忆实验将以上 组待测果蝇分别放入空指管内饥饿 后，放入 的烧杯中。烧杯中放有 个 带孔离心管，其中一个离心管内直接放入香蕉（可食离心管，也可简称为可食管），果蝇可闻到气味，并且通过孔洞进入离心管内时可直接吃到香蕉；另一个在香蕉的外面包有纱布，果蝇只能闻到气味，但无法吃到香蕉。每隔 记录进入无障碍可食离心管果蝇的数目，连续记录 ，每组记录 次，取平均值。测试时，每管内随机放置果蝇 只，每组别各测试管，每组共计 只，组共 只。果蝇脑组织 含量测定将果蝇脑组织匀浆提取液适当稀释，按 含量测定试剂盒步骤，用酶标仪在 处测定其 值，根据公式计算 含量。测定时，每 只果蝇为一个样本，每组别各测定 个样本，每组 只，组共 只。果蝇脑组织 含量的测定 按 试剂盒操作说明，用酶标仪在 处测定其 值，根据 回归曲线计算 含量。测定时，每 只果蝇为一个样本，每个组别各测定 个样本，每组 只，组共 只。果蝇脑组织 活性的测定按 试剂盒操作说明，用酶标仪在 处测定其 值，根据公式，计算 活性。测定时，每 只果蝇为一个样本，每个组别各测定 个样本，每组 只，组共 只。果蝇脑组织 含量的测定按 试剂盒操作说明，用酶标仪在 处测定其 值，根据公式，计算 含量。测定时，每 只果蝇为一个样本，每个组别各测定 个样本，每组 只，组共 只。果蝇脑组织 含量的测定按 试剂盒操作说明，用酶标仪在 处测定其 值，根据 回归曲线计算 含量。测定时，每 只果蝇为一个样本，每个组别各测定 个样本，每组 只，组共 只。果蝇脑组织 含量的测定按 试剂盒操作说明，用酶标仪在 处测定其 值，根据 回归曲线计算 含量。测定时，每 只果蝇为一个样本，每个组别各测定 个样本，每组 只，组共 只。统计学方法采用 统计软件进行数据分析，其中计量资料以均数 标准差（珋 ）表示，多组间比较采用单因素方差分析，以 为差异有统计学意义。结果 红参多糖对 转基因果蝇攀爬能力的影响雌性和雄性果蝇，野生组与模型组、红参多糖组、阳性对照组 差异有统计学意义（）。与模型组比较，红参多糖组、阳性对照组 均显著升高，差异有统计学意义（），此外，雌雄红参多糖组与阳性药对照组比较，差异无统计学意义（）。见表 。红参多糖对 转基因果蝇嗅觉记忆的影响各组果蝇进入无障碍可食离心管的数量随着时间的增长皆呈上升趋势，且在同一时间段内，野生组果蝇进入无障碍可食离心管的数量始终高于其他组，直至果蝇全部进入。与模型组比较，阳性对照组、红参多糖组进入无障碍可食离心管的数量显著增加，差异有统计学意义（或 ）；后，红参多糖组与野生组数量比较，差异无统计学意义（）；后，阳性对照组与野生组数量比较，差异无统计学意义（）。见表 ，图 。，表 红参多糖对 转基因雄 雌性果蝇攀爬能力的影响（珋 ）组别雄性果蝇样本数（只）攀附指数（）雌性果蝇样本数（只）攀附指数（）野生组 模型组 红参多糖组 阳性对照组 注：与模型组比较，；与野生组比较，表 红参多糖对 转基因果蝇嗅觉记忆的影响（珋 ，）组别野生组 模型组 红参多糖组 阳性对照组 组别野生组 模型组 红参多糖组 阳性对照组 注：与模型组比较，；与阳性对照组比较，；与野生组比较，图 不同给药组的 转基因果蝇各时段进入无障碍可食管的数量 红参多糖对 转基因果蝇脑组织 含量的影响组 差异有统计学意义（或 ）。与模型组比较，红参多糖组、阳性对照组果蝇脑组织 含量显著降低，差异有统计学意义（），而红参多糖组与阳性对照组比较，差异无统计学意义（）。见表 。表 红参多糖对 转基因果蝇脑组织 含量的影响（珋 ，）组别 含量（）野生组 模型组 红参多糖组 阳性对照组 注：与模型组比较，；与野生组比较，红参多糖对 转基因果蝇脑组织 活性和 含量的影响与模型组比较，红参多糖组、阳性对照组 活性均显著升高，差异均有统计学意义（均 ），而红参多糖组与阳性对照组比较，差异无统计学意义（）。与模型组比较，红参多糖组、阳性对照组 含量显著降低，差异均有统计学意义（均 ），而红参多糖组与阳性对照组比较，差异无统计学意义（）。见表 。表 红参多糖对 转基因果蝇脑组织 活性及 含量的影响（珋 ，）组别 活性（）含量（）野生组 模型组 红参多糖组 阳性对照组 注：与模型组比较，；与野生组比较，红参多糖对 转基因果蝇脑组织 、含量的影响组 含量差异有统计学意义（或 ）。与模型组比较，红参多糖组、阳性对照组的 、含量均显著降低，差异有统计学意义（），而红参多糖组与阳性对照组比较，差异无统计学意义（）。见表 。讨论神经元细胞外 沉积是 主要病理变化特征之一。脑脊液中其水平能够在一定程度上反映大世界中医药 年 月第 卷第 期表 红参多糖对 转基因果蝇脑组织 、含量的影响（珋 ，）组别 含量（）含量（）野生组 模型组 红参多糖组 阳性对照组 注：与模型组比较，；与野生组比较，脑中 的沉积。根据 末端结构分为 和 形式，在脑组织、脑脊液和血液中均能检测出。因此，、是临床比较公认的 诊断生物学标志物。其中，是大脑中毒性较强、易于形成原纤维的一种沉积 。是一种抗氧化酶，可以清除自由基 。是脂质发生过氧化反应产生的代谢产物，可作为机体脂质过氧化程度的指标 。大脑是耗氧最多、抗氧化酶较少的器官之一，导致其神经元清除自由基能力弱，不饱和脂肪酸更易氧化。此外，血脑屏障阻止了某些抗氧化剂通过。因此，大脑对氧化应激特别敏感，这是导致多种神经退行性疾病的主要原因 。氧化应激在 各阶段均表现明显，氧化程度随疾病进展而增加 。因此，抗氧化可能是开发治疗或延缓 治疗方法的有效途径。许海顺等 通过体外实验发现红参精制多糖具有一定的清除自由基及抗氧化作用。等 发现在 诱导的衰老小鼠中，红参较人参更能抑制 和 水平的升高，提高血清中 和过氧化氢酶（，）的表达并改善脑组织结构和行为学实验，认为红参抗衰老活性优于人参可能是依赖于其中存在更多的非淀粉多糖。是影响神经细胞信号转导的因子，在果蝇学习记忆中心蘑菇体神经细胞中发挥重要作用，的上调会减少神经元的存活造成神经毒性以及认知功能下降。乙酰胆碱为一类能对各类胆碱受体发挥特异性作用的神经递质，是乙酰胆碱的水解酶。当 水平下降时，脑内乙酰胆碱分解率降低，有利于神经信号的传导。所以 认知功能受损伤程度与 含量负相关 。中药多糖的抗 作用取得了很大的进展，并得到了广泛关注。胡文继 发现猴头菌发酵菌丝体纯化多糖能够改善 小鼠在行为学测试中的表现，可改善 小鼠脑中的神经元损伤，且对其他脏器无不良反应，同时该多糖还减少了小鼠海马区的 的沉积和 蛋白的过度磷酸化。研究表明，碳水化合物在蛋白质折叠、分泌、生物大分子识别和相互作用等过程中发挥着重要作用。因此，它们影响细胞的生长和分化、形态发生、迁移和信号转导等 。从忍冬花中分离到的均质多糖 ，它能以剂量依赖性的方式抑制 的聚集，并减弱在 神经母细胞瘤细胞中由 聚集诱导的细胞毒性 。等 发现红参多糖显著减轻了 小鼠 模型下丘细胞中 的积累、神经炎症、神经元丢失和线粒体功能障碍，改善了 处理的 细胞的线粒体缺陷。同时，红参多糖显著增加了健康和 大脑中神经干细胞的成人海马神经发生，显著增加了 细胞的增殖，增强和恢复了 小鼠的认知功能。其认为红参多糖参与老年大脑中枢神经系统组织维持的蛋白质的改变，并改善了 的病理状况，认为红参多糖可能是衰老和 治疗的潜在候选药物。课题组前期实验发现，红参较人参有更好的防治 作用，推测红参中多糖以及皂苷的变化可能是增强防治 的活性基础 。以往对于红参的研究主要集中在皂苷上，尤其是稀有皂苷 。研究表明红参皂苷对衰老和年龄相关神经退行性疾病具有疗效，然而目前关于红参多糖在衰老和 大脑中的治疗应用和可能的作用机制研究较少。课题组前期通过对红参中的多糖含量进行测定，发现其含量较高（约为 ），且中药多糖对抗 的作用取得了很大的进展，故开展本研究以探讨红参多糖对于 的治疗作用。本研究从果蝇攀爬能力实验，嗅觉记忆实验，果蝇脑组织 、及 的水平论证了红参多糖对于 果蝇的治疗作用。实验结果表明，红参多糖可显著提高 转基因果蝇的 以及进入无障碍可食管的数量。嗅觉短期记忆能力实验发现，果蝇可以凭借敏锐的嗅觉来辨认气味的方向，经过多次练习后，最后能趋向可以吃到的食物，避开不能吃到的食物。此外，红参多糖可降低果蝇脑组织 、的含量，提高果蝇脑组织 活性。由此得出，红参多糖对 确有治疗作用，包括提高果蝇的运动能力、学习记忆能力、改善认知功能障碍。其作用机制可能与其改善果蝇脑组织 蛋白沉积、抗氧化、改善神经细胞信号转导等方面有关，这一结论为红参的开发利用提供了又一可靠思路。利益冲突声明：无。，参考文献 王少锋，郝彦伟，李佳欣，等 益气化痰类中药复方对阿尔茨海默病神经保护作用的研究进展 中国实验方剂学杂志，（）：国家药典委员会 中华人民共和国药典（一部）北京：中国医药科技出版社，：包涵 利用果蝇模型对两种神经退行性疾病机理的研究 长春：吉林大学，华永庆，朱悦，江帆，等 模式生物果蝇在中药活性评价及其治疗功效表征中的应用与展望 中国中药杂志，（）：吴志浩 建立果蝇模型研究人类泛酸激酶依赖型神经退行性疾病 北京：清华大学，武永生 用果蝇研究神经退行性疾病：突变体筛选和 的作用 北京：清华大学，刘佳维，岳超颖，吴?，等 红参多糖对小鼠抗氧化能力的研究 中国食品添加剂，（）：，：，：王雪松，孔立红，余超超，等 阿尔茨海默病外周血早期生物标志物的研究进展 中国全科医学，（）：方佳慧，刘嘉玮，姜郁昕，等 五味子根、茎、叶、果多糖对 半乳糖致衰老小鼠运动耐力的影响 中国实验方剂学杂志，（）：胡雅娟，胡格吉胡，石海霞，等 银杏叶注射液对丙泊酚麻醉引起的大鼠认知功能障碍的影响 世界中医药，（）：，：，（）：，（）：许海顺，蒋剑平，徐攀，等 红参多糖抗氧化活性的研究 浙江中医药大学学报，（）：魏罡 酶辅助提取牡丹籽油及其改善果蝇认知障碍作用研究 哈尔滨：东北林业大学，胡文继 猴头菌发酵菌丝体纯化多糖的抗阿尔茨海默症活性研究 长春：吉林大学，：，（）：，：屈文佳，苏佳明，徐文娟，等 基于多成分定量分析的市售红参药材质量评价研究 中国中药杂志，（）：王丹，吕永磊，徐丽媛，等 人参多糖含量测定方法研究 中华中医药杂志，（）：（收稿本文编辑：张晓辉）（上接第 页），（）：，（）：，（）：，：，：，；，（）：，：，（）：，（）：，（）：（收稿本文编辑：张晓辉）世界中医药 年 月第 卷第 期