2023年结直肠癌异时性肝转移的分子标志物miRa及其生物学功能（教学课件）.ppt

结直肠癌异时性肝转移的分子标结直肠癌异时性肝转移的分子标志物：志物：miRmiR-181a181a及其生物学功能及其生物学功能 顾晋顾晋 陈治国陈治国 北京肿瘤医院北京肿瘤医院 北京大学临床肿瘤学院北京大学临床肿瘤学院 研究背景研究背景 microRNAmicroRNA的概念及其作用机制的概念及其作用机制 研究背景研究背景 miRNAmiRNA对肿瘤的发生开展起着重要的作用对肿瘤的发生开展起着重要的作用 miRNAmiRNA在不同肿瘤组织中具有特征性表达模式在不同肿瘤组织中具有特征性表达模式 miRNAmiRNA与肿瘤的生物学行为密切相关与肿瘤的生物学行为密切相关 可用于诊断可用于诊断CLLCLL、乳腺癌和软组织肉瘤等肿瘤、乳腺癌和软组织肉瘤等肿瘤 miRNAmiRNA与结直肠癌与结直肠癌CRCCRC肝转移的关系？肝转移的关系？实验目的实验目的 筛选可能有助于预测筛选可能有助于预测CRCCRC肝转移的肝转移的miRNAsmiRNAs CRCCRC肝转移相关的肝转移相关的miRNAsmiRNAs功能研究功能研究 无肝转移的无肝转移的CRCCRC 肝转移肝转移 miRNAmiRNA表达的芯片检测表达的芯片检测 伴有同时性肝转移的伴有同时性肝转移的CRCCRC 生物信息学分析生物信息学分析 原位杂交检测原位杂交检测 筛选出筛选出CRCCRC肝转移相关肝转移相关miRNAsmiRNAs 分子生物学验证分子生物学验证 组织芯片构建组织芯片构建 实验方案实验方案 实验方案实验方案 体外培养体外培养 病毒感染病毒感染 基因增强表达效率测定基因增强表达效率测定 比较转染前后生物学性状的改变比较转染前后生物学性状的改变 低转移潜能低转移潜能CRCCRC细胞系细胞系HT29HT29 接种接种 裸鼠移殖瘤裸鼠移殖瘤 裸鼠局部裸鼠局部成瘤能力成瘤能力 浸润浸润能力能力 生长生长增殖增殖 裸鼠局部瘤的裸鼠局部瘤的转移潜能转移潜能 携带携带miRNAmiRNA前体的慢前体的慢病毒表达载体病毒表达载体 实验结果实验结果 完成完成miRNAmiRNA芯片检测芯片检测 无肝转移的无肝转移的CRCCRC组织：组织：5 5例例 伴有同时性肝转移的伴有同时性肝转移的CRCCRC组织：组织：5 5例例 筛选出筛选出7 7个在两组间差异表达倍数大于个在两组间差异表达倍数大于1.71.7倍的倍的miRNAsmiRNAs miRmiR-181a181a，152152，320a320a LetLet-7d7d，miRmiR-15b15b，20b20b，223223 实验结果实验结果 构建组织芯片构建组织芯片 同时性肝转移的同时性肝转移的CRCCRC原发灶原发灶：n=160 异时性肝转移的异时性肝转移的CRCCRC原发灶原发灶：n=37 无肝转移的无肝转移的CRCCRC原发灶：原发灶：n=97 远癌正常远癌正常CRCCRC粘膜：粘膜：n=72 原位杂交原位杂交 DigDig标记的标记的LNALNA探针探针 实验结果实验结果 构建慢病毒过表达载体构建慢病毒过表达载体 LV-miR-181a-GFP LV-NC-GFP 慢病毒载体转染慢病毒载体转染HT29HT29细胞系细胞系 实验结果实验结果 Figure 1.miRNA detection Figure 1.miRNA detection in colorectal cancer in colorectal cancer tissues by LNAtissues by LNA-ISH.ISH.表表1.miRNAs1.miRNAs在在CRCCRC组织中的表达情况组织中的表达情况 Synchronous LM n=160 Without LM n=97 Metachronous LM n=37 Normal mucosa N=72 P value miR-320a 94/153(61.4%)38/93(40.9%)22/34（64.7%）17/58(29.3%)0.002 miR-20b 22/157(14.0%)12/97(12.4%)7/37(18.9%)4/72(5.5%)0.630 miR-181a 63/158(39.9%)16/96(16.7%)20/33(60.6%)14/72(19.4%)0.001 Let-7d 70/159(44.0%)54/96(56.1%)23/37(62.1%)30/70(42.9%)0.065 miR-223 55/158(34.8%)31/93(33.3%)14/37(37.8%)24/60(40.0%)0.780 miR-15b 76/153(49.7%)56/96(58.3%)19/33(57.6%)60/72(83%)0.056 miR-152 65/153(42.5%)36/94(38.3%)17/34(50.0%)29/61(47.5%)0.287 Figure 2.overall survival in CRC patients with Figure 2.overall survival in CRC patients with different expression level of miRdifferent expression level of miR-181a 181a Figure 3.The expression of reporter gene GFP in HT29 cell line 020406080100120140160180HT29-181a-GFPHT29-NC-GFPHT29Fold change of miR-181aexpressionHT29-181a-GFPHT29-NC-GFPHT29Figure 4.The fold change of the miR-181a expression in cell line Figure 5.miR-181a enhance the proliferation of HT29 cell 051015202512345DaysCell Preliferation RateHT29-181a-GFPHT29-NC-GFPHT29Figure 6.miR-181a enhance the migration of HT29 cell in vitro Figure 7.miR-181a enhance the migration and invasion of HT29 cell in vitro 00.20.40.60.811.21.41.61.8291113151719212325DaysTumor volume cm3HT29-181a-GFPHT29-NC-GFPHT29Figure 8.In vivo tumor growth in NOD-SCID mice Figure 9.Xenograft tumors in three groups 结论结论 miR-181a对预测CRC异时性肝转移可能具有重要的意义 miR-181a高表达是预后不良的分子标志物 miR-181a促进HT29细胞的生长，迁移和浸润 对miR-181a功能的后续研究可能有助于说明CRC异时性肝转移的调控机理