2023年细胞凋亡与增殖的原位检测（教学课件）.ppt

细胞增殖与凋亡的原位检测技术细胞增殖与凋亡的原位检测技术 一、细胞增殖活性原位检测技术一、细胞增殖活性原位检测技术 细胞增殖细胞增殖(cell proliferation)是细胞数量的增加，其快慢即为增殖活性。G1期期(gap1)，指从有丝分裂完成到期，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；复制之前的间隙时间；G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。S期期(synthesis phase)，指，指DNA复制的时期，复制的时期，G2期期(gap2)，指，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；M期又称期又称D期期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。，细胞分裂开始到结束。细胞周期图细胞周期图 G0期细胞：细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期期细胞：细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期 依据细胞的分裂能力，机体的细胞分为三类：依据细胞的分裂能力，机体的细胞分为三类：不稳定细胞不稳定细胞(labile cells)，持续分裂细胞持续分裂细胞 稳定细胞稳定细胞(stable cells)，静止细胞静止细胞 处处G0期期 永久细胞永久细胞(permanent cells)，不可逆地脱离不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞 根据细胞周期将细胞群分为两类根据细胞周期将细胞群分为两类 分裂细胞分裂细胞指进入指进入G1期后进行分裂的细胞；期后进行分裂的细胞；非分裂细胞非分裂细胞是指处于是指处于G0期细胞及非增生的终末细胞。期细胞及非增生的终末细胞。肿瘤细胞群也如此。肿瘤细胞群也如此。增殖分数或生长分数增殖分数或生长分数 分裂细胞与细胞总数之比值。分裂细胞与细胞总数之比值。生长分数值越大，增殖活性越高。生长分数值越大，增殖活性越高。测定生长分数能判断细胞群的增殖活性，测定生长分数能判断细胞群的增殖活性，即增殖快慢。即增殖快慢。生理状态下：生理状态下：不稳定细胞、稳定细胞呈现着活泼或较活泼不稳定细胞、稳定细胞呈现着活泼或较活泼的增生，补充因凋亡而丧失的细胞，保持机体、的增生，补充因凋亡而丧失的细胞，保持机体、器官或组织细胞数量的动态平衡器官或组织细胞数量的动态平衡。病理状态下：病理状态下：反响性增生反响性增生 组织细胞损伤或炎症刺激等均组织细胞损伤或炎症刺激等均可引起细胞增生可引起细胞增生；肿瘤性增生肿瘤性增生 肿瘤的本质是细胞增生紊乱所肿瘤的本质是细胞增生紊乱所致。即使去除刺激因素，瘤细胞仍可持续增生。致。即使去除刺激因素，瘤细胞仍可持续增生。原位研究细胞增生活性，不仅原位研究细胞增生活性，不仅涉及生理性及反响性细胞增生，更涉及生理性及反响性细胞增生，更多是研究肿瘤细胞的增生活性。多是研究肿瘤细胞的增生活性。一一原位检测细胞增生活性的常用方法及本卷须知原位检测细胞增生活性的常用方法及本卷须知 测定细胞增生活性的方法有：测定细胞增生活性的方法有：核分裂像计数核分裂像计数 Feulgen染色后显微分光光度法染色后显微分光光度法 免疫组织免疫组织或细胞或细胞化学技术显示与细胞增生与化学技术显示与细胞增生与 分裂分裂 相关的抗原相关的抗原 嗜银核仁组织区法嗜银核仁组织区法(argyrophil-stained nucleolar organizer region AgNORs)3H标记胸腺嘧啶脱氧核苷掺入标记技术标记胸腺嘧啶脱氧核苷掺入标记技术 溴脱氧尿嘧啶核苷溴脱氧尿嘧啶核苷胸腺嘧啶脱氧核苷相似物胸腺嘧啶脱氧核苷相似物标记技术标记技术 流式细胞术测定流式细胞术测定S期细胞分数期细胞分数 1.核分裂像计数核分裂像计数 核分裂像是人们可直接识别的细胞周期核分裂像是人们可直接识别的细胞周期不同阶段的唯一细胞形态。因此，用光学显不同阶段的唯一细胞形态。因此，用光学显微镜就能进行计数。微镜就能进行计数。核分裂像计数有两种方法核分裂像计数有两种方法 高倍视野法高倍视野法HPF 一般在一般在400倍放大下，倍放大下，随机选择一定数量随机选择一定数量10个个或更多或更多的的HPF，分别观，分别观察并计数其中的核分裂像，察并计数其中的核分裂像，最后算出平均每个最后算出平均每个HPF中中的核分裂像数。的核分裂像数。核分裂指数核分裂指数MI 测量时，可在显微镜目测量时，可在显微镜目镜内放置网格测微尺，随机镜内放置网格测微尺，随机选择一定数量的视野，计数选择一定数量的视野，计数不同区域一定数量的网格内不同区域一定数量的网格内核分裂像数，最后算出占所核分裂像数，最后算出占所测细胞总数之比例，实质上，测细胞总数之比例，实质上，也是一种生长分数也是一种生长分数。本卷须知：本卷须知：严格控制切片厚度严格控制切片厚度 在较厚的切片观察时，微调显在较厚的切片观察时，微调显微镜可在不同平面计数核分裂像，与较薄切片相比，显微镜可在不同平面计数核分裂像，与较薄切片相比，显然增加了计数时机。然增加了计数时机。组织标本固定时间组织标本固定时间 假设组织不及时固定，细胞仍假设组织不及时固定，细胞仍有分裂时机，也会增加核分裂计数可能性。有分裂时机，也会增加核分裂计数可能性。切片不能过染切片不能过染 切片过染会导致核分裂像识别困难。切片过染会导致核分裂像识别困难。用同一台或用同一台或HPF面积相同的显微镜计数面积相同的显微镜计数 2.免疫组织免疫组织或细胞或细胞化学方法化学方法 通过染色细胞增生相关的核蛋白判断细胞的通过染色细胞增生相关的核蛋白判断细胞的增生活性。增生活性。Ki67 因其所测的蛋白只表达在因其所测的蛋白只表达在G1，G2，M和和S期的细胞，期的细胞，G0 期及期及G1早期细胞不表达。早期细胞不表达。PCNA 是针对增殖细胞核抗原是针对增殖细胞核抗原proliferating cell nuclear antigen，PCNA的抗体。在除的抗体。在除G0期外的其它时相细胞均可测出。但水期外的其它时相细胞均可测出。但水平不一，平不一，G1期迅速增加，期迅速增加，G1/S交界交界期达顶峰，期达顶峰，S期维持高水平，期维持高水平，G2期开期开始下降，始下降，G1早期和早期和M期表达水平最低。期表达水平最低。MCM蛋白蛋白微染色体维持蛋白微染色体维持蛋白 是启动是启动DNA复制和延伸的关复制和延伸的关键蛋白。只在具有增殖潜能和增键蛋白。只在具有增殖潜能和增殖细胞中表达。可显示整个细胞殖细胞中表达。可显示整个细胞周期细胞。周期细胞。DNA拓扑异构酶拓扑异构酶a 是一种核酶，参与是一种核酶，参与DNA复制、复制、基因转录、染色体聚集及催化有丝分基因转录、染色体聚集及催化有丝分裂和减数分裂的染色体别离，在细胞裂和减数分裂的染色体别离，在细胞增殖中其重要作用。增殖中其重要作用。细胞周期中不同时期的关卡蛋白或调节元件细胞周期中不同时期的关卡蛋白或调节元件 细胞周期素细胞周期素A、B、C、D、E 周期素依赖性激酶周期素依赖性激酶CDK Ki67或或PCNA抗原在核内表达故增抗原在核内表达故增生细胞的核呈棕色或红色，用苏木素衬染生细胞的核呈棕色或红色，用苏木素衬染也能清楚区分阳性与阴性细胞。也能清楚区分阳性与阴性细胞。Ki67 Ki67 肠腺瘤 肠腺癌 Ki67 Ki67 PCNA PCNA PCNA Ki67LI，PCNA LI 采用计数核分裂像的方法，计数并算出标记细胞与所测细胞总数之比，称为标记指数1abelling index，LI，也是一种生长分数。肠腺瘤 肠腺癌 3.DNA含量测定含量测定 正常体细胞含二倍体基因组DNA。S期的DNA合成使细胞遗传信息增加。并可出现二倍体以上甚至四倍体DNA。因此，能测量DNA含量的方法，如胸腺嘧啶标记、溴脱氧尿核甙掺入、流式细胞术及Feulgen染色后均可测定细胞的DNA含量，但能在原位检测者，是Feulgen染色后显微分光光度计或计算机图像分析，Feulgen染色 测定时以组织中的静息淋巴细胞DNA含量为二倍体对照。与所测细胞比较，就可测出DNA含量不同的增生细胞的比例。4.嗜银核仁组织区法嗜银核仁组织区法 NORs含有核糖体基因和一些对银有高亲和含有核糖体基因和一些对银有高亲和性的酸性蛋白质。简单的一步银染法即可显示性的酸性蛋白质。简单的一步银染法即可显示NORs。光镜下，。光镜下，NORs为的黑色小点多数为的黑色小点多数直径约直径约0.51um，位于核内，也可见于分裂细，位于核内，也可见于分裂细胞的染色体上。胞的染色体上。AgNOR AgNORs计数方法计数方法 人工光镜观察组织切片时应计数至少人工光镜观察组织切片时应计数至少100个细个细胞，而观察涂片为胞，而观察涂片为50个细胞。如用全自动图像分个细胞。如用全自动图像分析仪计算机计数，可计数数百或更多细胞。最后将析仪计算机计数，可计数数百或更多细胞。最后将结果表示为单位细胞核的结果表示为单位细胞核的AgNORs颗粒数。研究颗粒数。研究资料说明，除资料说明，除AgNORs颗粒数外，其形态分类及颗粒数外，其形态分类及分布部位在良恶性肿瘤的鉴别中也有应用价值。分布部位在良恶性肿瘤的鉴别中也有应用价值。应特别注意计数区域的选择应有良好的随机性。应特别注意计数区域的选择应有良好的随机性。测定细胞增生活性方法间的关系及其选用测定细胞增生活性方法间的关系及其选用 原位测定细胞增生活性要求方法简单、经济、原位测定细胞增生活性要求方法简单、经济、重复性好、能常规使用，结果容易判断。以此为重复性好、能常规使用，结果容易判断。以此为标准，核分裂像计数、免疫组织标准，核分裂像计数、免疫组织或细胞或细胞化学化学及及AgNORs都有各自的优点。都有各自的优点。feulgen染色与流式细胞术相比，不需要将组织制成细胞悬液，所测得的增生活性更能反映组织原位的本来面貌。原位测定细胞增生活性所测的结果都可定量表示，大大防止了主观因素的影响，成为定量病理学的重要组成局部。各种方法相关性的比较研究说明核分裂像计数、Ki67 LI、PCNA LI及AgNORs计数等之间均有明显的相关性。如果您的实验室暂时尚不具备现代如果您的实验室暂时尚不具备现代实验条件只要有显微镜，只要您能准实验条件只要有显微镜，只要您能准确识别核分裂像，只要能防止那些影响确识别核分裂像，只要能防止那些影响重复性的因素，在创新思想的设计下，重复性的因素，在创新思想的设计下，即便使用最简单的方法，也可取得有意即便使用最简单的方法，也可取得有意义的结果。义的结果。二二 测定细胞增生活性的应用与价值测定细胞增生活性的应用与价值 判断肿瘤的良恶性判断肿瘤的良恶性 肿瘤的病理学分级肿瘤的病理学分级 判断肿瘤患者预后判断肿瘤患者预后 测定细胞增生活性除在肿瘤学领域广泛应用外，在有的非肿瘤性疾病如肾小球肾炎增生细胞的研究已有广泛应用，在其它疾病如类风湿性疾病，宫内膜异位症等已有报道，在凡涉及反响性增生的疾病中，也有广泛应用的前景。细胞凋亡apoptosis，或称程序性细胞死亡programmed cell death,PCD或细胞自杀cell suicide，是细胞自身的一种主动的、生理性死亡机制，是一个多步骤发生的、受基因调控的遗传机制。二、细胞凋亡检测技术二、细胞凋亡检测技术 细胞坏死与细胞凋亡示意图 1.正常细胞 2.凋亡细胞皱缩 3.凋亡细胞分叶 凋亡小体形成 4.巨噬细胞吞噬凋亡小体 5.细胞肿胀 6.细胞崩解、自溶 一一凋亡过程中细胞的形态学变化凋亡过程中细胞的形态学变化 二二细胞凋亡的形态学检测方法细胞凋亡的形态学检测方法 大局部情况下发生的凋亡都具有典型的形态大局部情况下发生的凋亡都具有典型的形态学特征，因此可通过各种方法制片及染色后，用学特征，因此可通过各种方法制片及染色后，用光镜、荧光显微镜，或电子显微镜进行观察，其光镜、荧光显微镜，或电子显微镜进行观察，其识别比较容易。识别比较容易。1.凋亡细胞的光镜和荧光显微镜检测凋亡细胞的光镜和荧光显微镜检测 1制片制片