癌相关成纤维细胞外泌体miR-34c-5p对胃癌细胞干细胞样表型的影响.pdf

医学分子生物学杂志,2023,20(5):432-438 J Med Mol Biol,2023,20(5):432-438DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2023.05.009资助项目:南充市科技项目应用基础课题研究(No.19SXHZ0323)通讯作者:王攀(电话:13990768533,E-mail:)This work was supported by a grant from the Application of Science andTechnology Research Projects in Nanchong(No.19SXHZ0323)Corresponding author:WANG Pan(Tel:86-13990768533,E-mail:ncwan-)癌相关成纤维细胞外泌体 miR-34c-5p 对胃癌细胞干细胞样表型的影响徐秀连,谢平,印隆宽,袁华燕,刘建军,王攀川北医学院附属医院胃肠外一科 四川省南充市,637000【摘要】目的 探讨癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)来源的外泌体 miR-34c-5p 是否有助于促进胃癌(gastric carcinoma,GC)细胞的干细胞样特性。方法收集并鉴定初代培养的 CAFs 和配对的正常成纤维细胞(normol fibroblasts,NFs)的外泌体,检测 CAFs 和 NFs 之间外泌体中 miR-34c-5p 的差异表达。CCK8 实验检测 GC 细胞活力;克隆形成实验检测 GC 细胞增殖能力;Transwell 实验检测 GC 细胞侵袭能力;细胞成球形成实验评估 GC 细胞成球能力;蛋白质印迹法检测细胞干细胞特性相关蛋白的表达。结果 miR-34c-5p 在 CAFs 衍生的外泌体中的表达显著降低。与 CAFs-exo 组比较,CAFs-exo 中 miR-34c-5p 抑制 GC 细胞的增殖和侵袭能力(P0.05);抑制 GC 细胞成球,并降低 SOX2、OCT4 和 NANOG 蛋白的表达水平,有显著性差异(P0.05)。结论 CAFs 来源的外泌体 miR-34c-5p 抑制 GC 细胞的干细胞样表型。【关键词】癌相关成纤维细胞;外泌体;胃癌;miR-34c-5p;干细胞特性【中图分类号】R735.2Effect of Cancer-associated Fibroblast Exosomal miR-34c-5p on Gas-tric Cancer Stem Cell-like PhenotypeXU Xiulian,XIE Ping,YIN Longkuan,YUAN Huayan,LIU Jianjun,WANG PanDepartment of Gastrointestinal Surgery,Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College,Nan-chong,637000,China【Abstract】Objective To investigate the effect of exosomal miR-34c-5p derived from cancer-associated fibroblasts(CAFs)on the stem-like properties of gastric cancer(GC)cells.MethodsExosomes from primary cultured CAFs and paired normal fibroblasts(NFs)were collected and i-dentified,and the differential expression of exosomal miR-34c-5p between CAFs and NFs was de-tected.The viability of GC cells was detected by CCK8 assay.The proliferation of GC cells was de-tected by colony formation assay.The invasive ability of GC cells was detected by Transwell as-say.The sphere formation capability of GC cells was evaluated by sphere formation assay.The expres-sion levels of stemness-related proteins were detected by Western blotting(WB)assay.ResultsThe expression level of miR-34c-5p in CAFs derived exosomes was significantly decreased.miR-34c-5p from the CAFs-exo inhibited the proliferation,invasion and sphere formation of GC cells,andreduced the expression levels of SOX2,OCT4 and NANOG proteins,when compared with those inthe CAFs-exo group(P1,334医学分子生物学杂志,2023,20(5):432-438 J Med Mol Biol,2023,20(5):432-438P0.05。1.8 透射电镜术将外泌体滴到铜网格上,并用2%磷钨酸进行2 min 的负染色。空气干燥后,使用 FEI Tecnai G2Spirit 透射电子显微镜(美国 Thermo 公司)在 80kV 下观察样品。1.9 荧光原位杂交实验根据制造商提供的说明,使用荧光原位杂交试剂盒检测 miR-34c-5p 的表达。用 4%甲醛固定 10min,并在4 下在5%Triton X-100 中渗透5 min。用 PBS 冲洗 3 次,37 下在 RNA-FISH 杂交系统(北京诺为生物公司)中预杂交30 min,然后用抗-miR-34c-5pa 寡核苷酸探针孵育过夜,同时保护其不受光照。最后,用 DAPI 对细胞进行复染,并用共焦激光扫描显微镜成像。1.10 细胞培养和细胞转染胃癌细胞系(MGC-803 和 SGC-7901)购自美国 ATCC 公司。在 37 和 5%CO2条件下,在含有 1%青霉素/链霉素和10%FBS 的 DMEM 培养基中常规培养。使用 Lipofectamine 2000 试剂(美国 Invitrogen 公司)将 miR-34c-5p 表达载体和慢病毒质粒混合物(上海生工生物公司)共转染到 293T 细胞中。转染 48 h 后,收集含病毒的上清液并过滤,然后将上清液用无血清 DMEM 稀释2 倍,并加入聚凝胺(5 g/mL)。将混合溶液添加到 CAFs 中,并在与新鲜培养基交换之前孵育24 h。用嘌呤霉素(10 g/mL)选择稳定转染的CAFs。1.11 菌落形成试验转染 24 h 后,将细胞接种到含有 2 mL 完全培养基,0.6%琼脂(美国 Gibco 公司)的 6 孔板(500 个细胞/孔)中,并在 37 5%CO2培养箱中培养 2 周。当克隆肉眼可见时,终止培养并移除培养基。PBS 中漂洗 2 次,然后用 1.5 mL 甲醛固定 15 min,并在黑暗中用 1%结晶紫溶液染色 20min,在显微镜下检查菌落(超过 50 个细胞)并拍照。1.12 Transwell 实验将相同数量的 MGC-803 和 SGC-7901 细胞悬浮在 200 L 无血清 DMEM 中,并接种在涂有 matri-gel(美国康宁公司)transwell 小室上室中。下室含有 600 L DMEM。将 3 种不同的外泌体(exo-miR-34c-5p、exo-miR NC 和 exo 对照)添加到上室并孵育 24 h,然后用棉签去除上室上表面的细胞。通过基质凝胶迁移到上室下表面的细胞用甲醇固定15 min,用 0.1%结晶紫染色 15 min,并用光学显微镜计数。1.13 细胞成球形成实验将转染 3 种不同的外泌体(exo-miR-34c-5p、exo-miR NC 和 exo 对照)的 MGC-803 和 SGC-7901细胞孵育在含有 4 ng/mL 胰岛素(美国 Sigma 公司)、2%B27(美国 Thermo Fisher 公司)、20 ng/mL EGF(美国 Sigma 公司),10 ng/mL FGF(美国Sigma 公司)的 DMEM 培养基中培养。培养 14 d后,在光镜下计数 3 组细胞形成的球体(大于 20个细胞)。1.14 蛋白质印迹实验(Western blotting,WB)用 RIPA 裂解缓冲液在 4 下提取细胞总蛋白,使用 BCA 试剂盒测定蛋白质浓度。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶对目标蛋白质进行电泳,然后转移到聚偏氟乙烯膜上。用含5%脱脂牛奶的TBST 封闭膜 1 h 后,用稀释的一抗 CD9(1600)、TSG101(1 600)、Calnexin(1 1 200)、SOX2(11 500)、OCT4(1 1 000)、NANOG(1 500)和-actin(11 000)于 4 孵育过夜。然后,将膜与辣根过氧化物酶结合的二抗(11 000)于37 孵育 2 h,并使用增强化学发光试剂 ECL 显示条带,用 Image J 定量蛋白灰度值。1.15 统计学分析所有数据表示为 x s,采用 GraphPad Prism6.0 和 SPSS 22.0 软件进行数据分析,两组间比较采用 LSD-t 检验。2 结果2.1 GC 患者成纤维细胞特征首先,我们分别从同一患者的正常区和肿瘤区分离出 NFs 和 CAFs。显微镜下 NFs 和 CAFs 均呈长纺锤形形态,但 CAFs 比 NFs 略圆润。与 NFs 比较,2 种 CAF 特异性生物标志物-SMA 和 FAP 在CAFs 中过表达。原代培养的成纤维细胞群 NFs 和CAFs 的间充质标记物 Vimentin 均呈强阳性,表明成纤维细胞群成功分离(图 1)。2.2 GC 患者成纤维细胞来源的外泌体特征然后,我们从 NFs-exo 和 CAFs-exo 的上清液中分离外泌体,并通过 TEM、纳米颗粒跟踪分析(NTA)和蛋白质印迹法对分离出的囊泡进行鉴定。结果表明,这些囊泡直径(125 50)nm,圆形和杯状。与胞外囊泡比较,外泌体标记物 CD9和 TSG101 高表达,外泌体阴性标记物 Calnexin 阴性表达,表明分离的囊泡是外泌体(图 2)。434徐秀连,等.癌相关成纤维细胞外泌体 miR-34c-5p 对胃癌细胞干细胞样表型的影响A:GC 患者 NFs 和 CAF 形态学(100);B:免疫细胞化学染色检测 NFs 和 CAFs 中-SMA 和 FAP 的表达(100),免疫荧光染色检测 NFs 和 CAFs 中细胞 Vimentin 的表达(200)。1:NFs 组;2:CAFs 组图 1 GC 患者成纤维细胞特征A:TEM 观察 NFs-exo 和 CAFs-exo 形态(2 000);B:NTA 显示 NFs-exo 和 CAFs-exo 的大小;C:WB 检测 CD9、TSG101 和 Calnexin 的表达。1:胞外囊泡组;2:NFs 组;3:CAFs 组。与对照组比较,P0.01图 2 GC 患者 CAFs 外泌体的分离2.3 miR-34c-5p 在 CAF 衍生的外泌体中下调与 NFs-exo 比较,miR-34c-5p 在 CAFs-exo 中显著降低(P0.05)。与正常癌旁胃组织比较,miR-34c-5p 在 GC 患者组织样本中表达下调(P0.05),表明 CAFs-exo 表现出 miR-34c-5p 下调。因此,选择miR-34c-5p 作为本研究的目标基因(图3)。A:NFs-exo 和 CAFs-exo 的 miRNA 表达热图;B:NFs-exo 和 CAFs-exo 的 miRNA 表达散点图;C:miR-34c-5p 在NFs-exo 和 CAFs-exo 的表达;D:荧光原位杂交评估 GC 和正常组织中 miR-34c-5p 的表达(100)。与正常组织组比较,P0.01图 3 CAFs 来源的外泌体显示 miR-34c-5p 下调534医学分子生物学杂志,2023,20(5):432-438 J Med Mol Biol,2023,20(5):432-4382.4 外泌体 miR-34c-5p 抑制了 GC 细胞的增殖和侵袭能力与 CAFs-exo 组比较,CAFs-exo miR-34c-5p 组miR-34c-5p 在 MGC-803 和 SGC-7901 细胞中表达升高,表明 miR-34c-5p 成功从 CAFs 外泌体转染到GC 细 胞 中(P 0.05)。与 CAFs-exo 组 比 较,CAFs-exo miR-34c-5p 组的细胞表现出最低的增殖能力(P 0.05)。与 CAFs-exo 组比较,CAFs-exomiR-34c-5p 组的细胞表现出最弱的侵袭能力(P0.05),表明 miR-34c-5p 可抑制 GC 细胞的增殖和侵袭性(图 4)。A:qRT-PCR 评估外泌体 miR-34c-5p 转染 GC 细胞中 miR-34c-5p 的 mRNA 表达;B:CCK8 实验检测 GC 细胞活力;C:克隆形成实验检测 GC 细胞增殖能力;D:Transwell 实验检测 GC 细胞侵袭能力(100)。1:CAFs-exo 对照组;2:CAFs-exo miR-NC 组;3:CAFs-exo miR-34c-5p 组。与 CAFs-exo 对照组比较,P0.05;P0.01图 4 外泌体 miR-34c-5p 对 GC 细胞增殖和侵袭能力的影响2.5 外泌体 miR-34c-5p 抑制了 GC 细胞成球能力与 CAFs-exo 组比较,CAFs-exo miR-34c-5p 组培养的癌细胞形成的球体数最少,球体体积最小(P0.05)。蛋白质印迹检测细胞干性标志基因的蛋白表达。与 CAFs-exo 组比较,CAFs-exo miR-34c-5p 组 SOX2、OCT4 和 NANOG 蛋白表达降低(P 0.05),表明 miR-34c-5p 抑制 GC 细胞成球(图 5)。634徐秀连,等.癌相关成纤维细胞外泌体 miR-34c-5p 对胃癌细胞干细胞样表型的影响A:细胞成球形成实验评估 GC 细胞成球能力(40);B:WB 检测 GC 细胞中 SOX2、OCT4 和 NANOG 的蛋白表达。1:CAFs-exo 对照组;2:CAFs-exo miR-NC 组;3:CAFs-exo miR-34c-5p 组。与 CAFs-exo 对照组比较,P0.01图 5 外泌体 miR-34c-5p 对 GC 细胞成球能力的影响3 讨论近几十年来,微环境在癌症进展、转移和治疗中的作用越来越受到关注2,12。CAFs 已成为基质细胞中的关键角色,因为它们在大多数实体瘤中大量存在,并具有多种肿瘤抑制/促进作用10,13。本研究中,我们成功分离了胃癌患者源性 CAFs。CAFs 和癌细胞可以通过经典的旁分泌(细胞因子、趋化因子)信号机制14,也可以通过外泌体进行交流7,15。外泌体是内泌体衍生的微泡,包含脂质、蛋白质和核酸(如 miRNA 和 LncRNA)16。作为外泌体的主要 RNA 成分,miRNA 在几种类型的癌症中表达失调9-11,并调节癌症进展和转移。本研究中,我们通过外泌体分离试剂从 CAFs 和NFs 中分离出外泌体,并通过 TEM 和 NTA 鉴定外泌体形态和大小。此外,WB 显示 CD9 和 TSG101阳性表达,calnexin 无表达,这些结果表明我们分离的颗粒是合格的外泌体。据报道,CAFs 中一些关键 miRNAs 的丢失可能对癌细胞有显著的致瘤性影响17。本研究中,CAFs 中外泌体 miR-34c-5p 的缺失是我们研究中的一个重要发现。此外,与邻近正常组织比较,GC组织中 miR-34c-5p 的表达也较低。先前的研究表明,miR-34c-5p 在宫颈癌细胞组织中下调,并抑制宫颈癌的转移和侵袭18。相反,miR-34c-5p 在鼻咽癌组织中下调,并通过靶向 NOTCH1 显著抑制鼻咽癌细胞增殖和迁移19。目前,miR-34c-5p 是GC 中研究较少的 miRNA,尽管 WU 等20提出miR-34c-5p 的过度表达显著下调 MAPT 蛋白表达,并增加紫杉醇耐药 GC 细胞的化学敏感性,但 miR-34c-5p 在 GC 中所起的作用及其潜在机制尚未阐明。本研究中,与肿瘤实质中检测到的水平比较,miR-34c-5p 在基质中显著低表达。通过将 GC 细胞与从患者源性 CAFs 分离的外泌体孵育,我们用慢病毒载体建立了稳定转染的高表达 miR-34c-5p,证实 miR-34c-5p 被转移到癌细胞,并在体外抑制其增殖和转移。此外,在成球形成实验中,我们发现与 CAFs-exo 组比较,CAFs-exo miR-34c-5p 组培养的癌细胞形成了更少的球体。一些转录因子,如 OCT4、734医学分子生物学杂志,2023,20(5):432-438 J Med Mol Biol,2023,20(5):432-438SOX2 和 NANOG,可能参与了肿瘤干细胞样表型的维持21。本研究中,与 CAFs-exo 组比较,在使用 exo-miR-34c-5p 培养的癌细胞中,这 3 个基因的蛋白表达显著降低,表明 CAFs 外泌体衍生的 miR-34c-5p 过度表达可以显著降低这些干性基因的表达。综上所述,本研究证实外泌体 miR-34c-5p 缺失是一个重要的发现,这有助于维护 GC 细胞的生物学特性,包括增殖能力、侵袭、成球形成,以及干细胞样基因的表达,表明细胞外泌体 miR-34c-5p对 GC 治疗具有潜在价值。参考文献1 SMYTH E C,NILSSON M,GRABSCH H I,et al.GastriccancerJ.Lancet,2020,396(10251):635-648.2 XIAO Y,YU D.Tumor microenvironment as a therapeutictarget in cancerJ.Pharmacol Ther,2021,221:107753.3 MAO X,XU J,WANG W,et al.Crosstalk between 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