UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS法分析补肾降浊颗粒的化学成分.pdf

书书书第 卷第 期烟台大学学报（自然科学与工程版）年 月 （）文章编号：（）：欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍氥氥氥氥 研究简报收稿日期：基金项目：山东省自然科学基金重大基础研究项目（）；山东省中医药科技项目（）。通信作者：许卉（），教授，博士，主要研究方向为药品质量控制与药效物质基础。法分析补肾降浊颗粒的化学成分顾雪晶，孙正，郝腾，李艳丽，朱圆瑛，吴燕，康立圆，许卉（烟台大学药学院，山东 烟台 ；滨州市中医医院，山东 滨州 ）摘要：采用超高效液相色谱 四级杆 静电场轨道阱高分辨质谱对复方中药制剂补肾降浊颗粒中的化学成分进行定性分析。样品采用 柱（，）进行分离，以乙腈和 甲酸水为流动相进行梯度洗脱，电喷雾质谱检测，正、负离子模式下采集数据，通过化合物的精确相对分子质量、质谱裂解规律以及文献报道的质谱数据进行对比分析，共鉴定出 个化合物，包括萜类 个，有机酸类 个，黄酮类 个，糖和苷类 个，酚类 个，苯丙素类 个，生物碱 个，其他类 个。所建立的方法首次对补肾降浊颗粒的化学成分进行快速表征，结果准确，可为进一步的药效物质基础和质量控制提供依据。关键词：补肾降浊颗粒；糖尿病肾病；超高效液相色谱 四级杆 静电场轨道阱高分辨质谱；化学成分中图分类号：文献标志码：糖尿病肾病（，）是糖尿病最严重的慢性并发症之一，大约 的糖尿病患者会出现肾脏疾病，临床上以持续性白蛋白尿、肾小球滤过率进行性下降为主要特征，同时增加了患者患高血压和心血管疾病的风险 。中医认为 多因气阴两虚、肾气不固导致淤阻经脉，治疗需以补肾固精、益气活血为治疗原则 ，而补肾降浊颗粒具有补肾降浊、活血通络的功效。补肾降浊颗粒是在经典名方六味地黄丸基础上结合临床经验加味而成的院内中药制剂 ，经过临床反复实践，治疗 疗效确切，有利于延缓 发病进程。中药复方制剂成分十分复杂，发挥药效不是单一成分的简单加和，而是多成分协同起效 ，因此，同时检测尽可能多的化学成分至关重要。目前，补肾降浊颗粒的化学成分研究未见报道，而超高效液相色谱四级杆 静电场轨道阱高分辨质谱联用技术（）具有高选择性、高灵敏度、高准确度等优势，被广泛应用于中药复方物质基础研究 。本研究首次利用质谱联用技术对补肾降浊颗粒的化学成分进行快速分离鉴定，为进一步研究药效物质基础及质量控制提供参考。材料 高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔科技公司），四级杆 静电场轨道阱高分辨质谱仪（美国赛默飞世尔科技公司），型分析天平（瑞士 ），型台式高速冷冻离心机（上海湘仪实验室仪器开发有烟台大学学报（自然科学与工程版）第 卷限公司），型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司），补肾降浊颗粒（批号 ，滨州市中医院），甲醇、乙腈均为色谱纯（美国默克公司），娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。方法 检测条件 色谱条件色谱柱：（，），流动相：甲酸溶液（）乙腈（），梯度洗脱（，），流速：，柱温：，进样量：。质谱条件采用电喷雾离子源（），在正、负离子模式下分别进行检测，扫描范围：，鞘气流速：，辅助气流速：，喷雾电压：，辅助器温度：，离子化电压：，碰撞能量：、。溶液制备取补肾降浊颗粒适量，研细，取约 ，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇溶液 ，密塞，称定重量，超声处理 ，再次称重，用甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，过 滤膜，即得。数据分析采用 软件进行数据采集，根据高分辨质谱提供的准分子离子和加合离子等信息推测并得到精确相对分子质量，再由 软件拟合计算分子式，与 软件和本地自建数据库相匹配，依据化合物数据库及国内外文献报道的信息，确认化学成分及结构。结果采用 方法对补肾降浊颗粒的化学物质组成进行快速分析，按“”项下的色谱和质谱条件，分别进行正、负离子模式扫描，采集得到正、负离子模式下的色谱图，结果如图 所示。针对质谱中得到的准分子离子和特征碎片离子信息，结合文献进行分析，推测了 个化合物，其中主要包括黄酮类、有机酸类、酚类、萜类等，结果汇总见表 。分别选取各结构类型的代表性成分，根据一级和二级质谱数据，对化合物进行鉴定，分析化合物裂解方式。?图 总离子流色谱图 第 期顾雪晶，等：法分析补肾降浊颗粒的化学成分表 补肾降浊颗粒中的化学成分 分类化合物名称及其药材归属苯丙素类丹参素，香豆酸，肉苁蓉苷，阿魏醛，香豆素，肉苁蓉甙，菟丝子苷，棘皮苷，党参苷 异构体，芝麻素酚类 乙炔基苯酚，没食子酸，邻苯二酚，原儿茶醛，香兰素，白皮杉醇，虎杖苷，异毛蕊花糖苷，毛蕊花糖苷，紫丁香苷，丹酚酸，夹竹桃麻素，丹皮酚，（羟苯基）丁酮，异丹酚酸，（羟基苯基）乙基 甲氧基苯酚，去氧土大黄苷黄酮类儿茶素，表儿茶素，甲氧基 羟基异黄酮 葡萄糖苷，芦丁，毛蕊异黄酮葡萄糖苷，金丝桃苷，紫云英苷，木犀草素，圣草酚，毛蕊异黄酮，槲皮素，芒柄花苷，黄豆黄素，二羟基，二甲氧基异黄酮 葡萄糖，白杨素，芦荟大黄素，异鼠李素，（），三甲基 ，二氢 苯并呋喃 酮，大黄素，汉黄芩素，芒柄花素，美迪紫檀素，芹菜素，黄芩素，山奈酚，二羟基 ，二甲氧基异黄酮生物碱类甜菜碱，党参次碱，甲基吲哚糖和苷类没食子酸葡萄糖苷，腺苷，葡萄糖苷，栀子酸，京尼平苷，地黄苦苷，京尼平，当药苷，没食子酸氧化芍药苷，四没食子酰葡萄糖，焦地黄苷 ，圣草酚葡萄糖苷，尿苷，柚皮素葡萄糖苷，羟基 ，二甲氧基 枫香果聚糖，羟基 ，二甲氧基紫檀果聚糖，香芹苷，益母草苷，党参苷，二甲氧基紫檀果聚糖 葡萄糖萜类地黄素，焦地黄素，氧化芍药苷，牡丹皮苷，马钱素，羟基丹参酮 ，焦地黄素，牡丹皮苷，焦地黄素，山茱萸新苷，牡丹皮苷，氧代泽泻醇，白菖考烯，黄芪甲苷，黄芪皂苷，泽泻醇，白术内酯 ，环氧 泽泻醇，大豆皂苷 ，新隐丹参酮，脱氧隐丹参酮，羟基醌，丹参酮 ，茯苓新酸，泽泻醇，茯苓酸，异丹参酮 ，茯苓新酸，氧化泽泻醇，泽泻醇，猪苓酸，茯苓新酸，新隐丹参酮 ，丹参新酮，泽泻醇，茯苓新酸，多孔酸，齐墩果酸，去氧泽泻醇，土莫酸，乙酰泽泻醇，熊果酸，茯苓酸，乙酰基 乳香酸，去氢齿孔酸有机酸类金鸡纳酸，赖氨酸，（，）羟脯氨酸，烟酸，柠檬酸，三羟基苯甲酸，邻苯二甲酸，肉桂酸，缬氨酸，香草酸，原儿茶酸，丁氧基琥珀酸，反式 吲哚乙酸，丁香酸，表番木鳖酸，苯甲酸，对羟基苯甲酸，天冬氨酸，壬二酸，咖啡酸，反式 羟基环己烷 羧酸，棕榈酸，羟基 去甲酰基 ，（）二烯 酮 油酸，二羟基 十八碳烯酸，甘氨酸，二羟基烷 ，三烯 油酸，环氧 十八碳烯酸，羟基 ，十八碳二烯酸，肉 豆 蔻 酸，榄 香 酸，羟 基 十 六 酸，羟 基 亚 甲 基 羊 毛 甾 烯 油 酸，油酸，二羟基 齐墩果烯 酸其他类苯乙烯，维生素 ，谷甾醇，地芸普内酯，杜仲甲素，紫罗兰酮，甲基萘，羟苯基二醇，党参三醇，苯基双环 辛醇，（）芳樟醇，山醇，豆甾烷 ，二酮，麦维甾醇，注：上角标字母代表药材归属，黄芪，丹参，党参，山药，熟地，杜仲，菟丝子，益智仁，山茱萸，芡实，金樱子，大黄，牡丹皮，桑寄生，泽泻，茯苓。黄酮类化合物裂解途径分析共鉴别出黄酮类化合物 个，以化合物芒柄花苷为例，在正离子模式下经一级质谱扫描得准分子离子峰 ，预测其分子式为 ，二级质谱图显示 、。通过计算可以归属得到的碎片离子，准分子离子失去一个 ，得到基峰碎片离子 ；随后失去一个 ，断裂 ，得到碎片离子 ；准分子离子失去一个 ，得到碎片离子 ；随后断裂 ，得到碎片离子 。根据以上碎片离子信息，推测该化合物为芒柄花苷，其二级质谱图及可烟台大学学报（自然科学与工程版）第 卷能的质谱裂解途径见图。有机酸类化合物裂解途径分析共鉴别出有机酸类化合物 个，以化合物金鸡纳酸为例，在正离子模式下经一级质谱扫描得准分子离子峰 ，预测其分子式为 ，二 级 质 谱 图 显 示 、。通过计算可以归属得到的碎片离子，准分子离子失去一个 ，得 到 碎 片 离 子 ；随后失去一个 得到碎片离子 ；再失去一个 ，得到基峰碎片离子 ；准分子离子失去一个 ，得到碎片离子峰 ；随后再失去一个 ，一个 ，一个 ，得到碎片离子峰 。根据以上碎片离子信息，推测该化合物为金鸡纳酸，其二级质谱图及可能的质谱裂解途径见图 。OOOOOOHHHOHHO HOHHHOOOOH-OO-OHOH-+-?图 芒柄花苷二级质谱图和裂解途径 OHOOHOHHOHO-OHHOHOOHOHHOHO-HOHOOHOHOOHOHO-?图 金鸡纳酸二级质谱图和裂解途径 第 期顾雪晶，等：法分析补肾降浊颗粒的化学成分 萜类化合物裂解途径分析共鉴别出萜类化合物 个，以化合物丹参酮为例，在正离子模式下经一级质谱扫描得准分子离子峰 ，预测其分子式为为 ，二级质 谱 图 显 示 、。通过计算可以归属得到的碎片离子，准分子离子失去一个，得到碎片离子 ；随后失去，得到基峰碎片离子 ；再失去一个，得到碎片离子 ；准分子离子失去一个 和一个 ，得到碎片离子 ；再失去一个 和一个 ，得到碎片 。根据以上碎片离子信息，推测该化合物为丹参酮 ，其二级质谱图及可能的质谱裂解途径见图 。OOOOOO-O-OOO-O-+?图 丹参酮二级质谱图和裂解途径 酚类化合物裂解途径分析共鉴别出酚类化合物 个，以化合物白皮杉醇为例，在负离子模式下经一级质谱扫描得准分子离子峰 ，预测其分子式为 ，二级质谱图显示 、。通过计算可以归属得到的碎片离子，失去一分子的 ，得到碎片离子 ；失去 ，得到碎片离子 ；再失去一个，得 到 碎 片 离 子 ；再失去一个 ，得到碎片离子 。根据以上碎片离子信息，推测该化合物为白皮杉醇，其二级质谱图及可能的质谱裂解途径见图 。糖和苷类化合物裂解途径分析共鉴别出糖和苷类化合物 个，以化合物乙基 吡喃葡萄糖为例，在负离子模式下经一级质谱扫描得准分子离子峰 ，预测其 分 子 式 为 ，二 级 质 谱 图 显 示 、。通过计算可以归属得到的碎片离子，准分子离子失去一个 和一个 ，得到碎片离子 ；失 去 ，得 到 碎 片 离 子 ；失去，得 到 碎 片 离 子 。根据以上碎片离子信息，推测该化合物为乙基 吡喃葡萄糖，其二级质谱图及可能的质谱裂解途径见图 。烟台大学学报（自然科学与工程版）第 卷?OHOHHOOHHOOOOO-OO-_OO_-?图 白皮杉醇二级质谱图和裂解途径 OOHOOHHOOHOOOHOOHHOOOHOOOH-?图 乙基 吡喃葡萄糖二级质谱图和裂解途径 讨论目前已有多项关于补肾降浊药方中单味药材的研究，尚未有关于该复方颗粒中化学成分的报道。本研究采用的 技术，用于分析中药复方的复杂成分具有很大的优势，该技术结合了 的高灵敏性和 的高准确性 ，可以增加补肾降浊颗粒中化学成分的检出。对比正、负离子两种扫描模式，正离子模式下的质谱响应较强，但是不同化合物在不同扫描模式下响应不同 ，为获得全面的化合物信息，采用两种离子扫描模式以获得更全面的化合物信息。总离子流图可知出峰时间大多集中在 范围内。在建立色谱条件的过程中，选择梯度洗脱的目的是让样品中强保留组分也能被洗脱出来，该方法是组分复杂的样品常采用的洗脱方式 。为确定最佳的色谱条件，将 ，范围内的梯度变化加快，增加样品出峰数量，若使用比较缓慢的梯度会导致出峰较少、分离度差，而 范围内需要减慢梯度，以保证色谱峰的分离度，最终确定了最优的梯度洗脱条件。同时，在流动相中加入 甲酸溶液可有效改善峰型和离子化效果。结论本研究采用 技术，确定了最优的色谱和质谱条件，建立的检测方法用于补肾降浊颗粒的化学成分分析，高效、准确。总共鉴定出 个化学成分，正离子模式下鉴别出 个化合物，负离子模式下鉴别出 个化合物。首次明确了萜类、黄酮类、有机酸类化合物是补肾降浊颗粒的主要组成成分，从整体上明确了补肾降浊颗粒的化学成分，为进一步研究药效物质基础和质量控制提供了理论依据。第 期顾雪晶，等：法分析补肾降浊颗粒的化学成分参考文献：，（）：，：，（）：游鸿，盖云中医治疗早期糖尿病肾病研究进展 亚太传统医药，（）：郑娜茹六味地黄丸及衍生方的临床应用 转化医学电子杂志，（）：谭晓梅，刘昌顺，汤庆发，等基于功效成分体内过程的中药复方配伍及方证相应研究 世界科学技术 中医药现代化，（）：，（）：刘瑞，王瑞，裴科，等 快速鉴定羊红膻药材的化学成分 中国实验方剂学杂志，（）：王迪，俞佳，詹固，等液质联用技术在中药研究中的应用进展 中华中医药学刊，（）：胡雁萍，赵迪，李焕茹，等 高分辨质谱定量分析不同产地、炮制前后女贞子中 种成分的含量 天然产物研究与开发，（）：，（）：，（）：李杨杰，黄佳颖，方继辉，等超高效液相色谱 四极杆 飞行时间高分辨质谱快速筛查确证化妆品中 种常见禁用物质 色谱，（）：刘香易，曾锐，杨长传，等基于 技术的三草保肝汤化学成分分析 中国实验方剂学杂志，（）：，：，：，（，；，）：，（，），：；（责任编辑周雪莹）