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2023 年 9 月第 56 卷第 9 期烟草科技Tobacco Science&TechnologySep.2023Vol.56 No.9摘要：烟碱合成和腺毛发育与烟草品质和抗性密切相关，二者受茉莉酸信号的调控。JAZ1是茉莉酸信号途径中关键的负调控基因，为明确NtJAZ1基因敲除对烟碱生物合成、腺毛发育和分泌物积累的影响，采用CRISPR/Cas9技术对烤烟Y2001中的NtJAZ1进行编辑，获得了纯合突变株系HN。与Y2001相比，HN烟苗生长发育无明显差异，叶面腺毛密度降低，但腺头发育完善且比Y2001饱满，腺毛分泌物组分和含量（质量分数）无显著差异。烟苗叶片的烟碱含量提高19.38%，根系烟碱含量提高30.85%，根系中烟碱合成相关基因NtMYC2a、NtMYC2b、NtPMT和NtQPT的表达量极显著增加，烟苗对蚜虫抗性显著增强。NtJAZ1基因敲除虽然对烟腺毛发生有一定影响，但对腺头发育和分泌物合成有明显促进作用，可在不影响叶面分泌物组分和含量的基础上提高烟碱含量和对蚜虫的抗性。因此，NtJAZ1基因是改良烟草品质和抗性的重要靶点之一。关键词：烟草；NtJAZ1；基因编辑；烟碱；腺毛；蚜虫抗性中图分类号：S572.01文献标志码：A文章编号：1002-0861（2023）09-0001-09收稿日期：2022-10-26录用日期：2023-03-10基金项目：湖南中烟工业有限责任公司合作项目“多腺毛、高烟碱K326种质创制和育种应用研究”（202143000834089）。第一作者：侯子航（1998），男，硕士研究生，从事烟草生物技术研究。E-mail：*通信作者：崔红（1966），女，博士，教授，博士生导师，从事烟草腺毛发育及代谢调控研究。E-mail：cuihonger_引用本文：侯子航，罗锐，朱文奇，等.NtJAZ1基因敲除对烤烟Y2001烟碱合成和腺毛发育的影响 J.烟草科技，2023，56（9）：1-9.（HOU Zihang，LUO Rui，ZHU Wenqi，et al.Effects of NtJAZ1 knockout on nicotine synthesis and glandular trichomedevelopment of flue-cured tobacco Y2001 J.Tobacco Science&Technology，2023，56（9）：1-9.DOI：10.16135/j.issn1002-0861.2022.0780）NtJAZ1基因敲除对烤烟Y2001烟碱合成和腺毛发育的影响侯子航，罗锐，朱文奇，季盈彤，时兴铭，闫筱筱，崔红*河南农业大学烟草学院，郑州市郑东新区平安大道218号450046Effects of NtJAZ1 knockout on nicotine synthesis and glandular trichomedevelopment of flue-cured tobacco Y2001HOU Zihang,LUO Rui,ZHU Wenqi,JI Yingtong,SHI Xingming,YAN Xiaoxiao,CUI Hong*College of Tobacco,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450046,ChinaAbstract：Nicotine synthesis and glandular trichome development are closely related to tobaccoquality and resistance,both of which are regulated by jasmonic acid signaling.JAZ1 is a key negativeregulator gene in the jasmonic acid signaling pathway.To clarify the effects of NtJAZ1 knockout onnicotine biosynthesis,glandular trichome development and secretion accumulation,the CRISPR/Cas9technology was used to edit NtJAZ1 in flue-cured tobacco Y2001 and a pure mutant plant HN wasobtained.Compared to Y2001,HN tobacco seedlings showed no significant differences in growth anddevelopment,with a lower density of glandular trichomes on the leaf surface,but the glandular headswere well developed and fuller than the Y2001,and there were no significant differences in thefractions and contents(mass fraction)of glandular trichome secretions.The nicotine content oftobacco seedlings increased by 19.38%in leaves and 30.85%in roots,and the expression levels ofNtMYC2a,NtMYC2b,NtPMT and NtQPT,genes related to nicotine synthesis in roots,increasedextremely significantly;aphid resistance of tobacco seedlings was significantly improved.Knockoutof the NtJAZ1 gene affected tobacco glandular trichome development,but significantly promotedglandular head development and secretion synthesis,which improved nicotine content and aphid2023 年烟草科技resistance without affecting the leaf surface secretion composition and content.Therefore,the NtJAZ1gene is an important target for tobacco quality and resistance improvement.Keywords：Nicotiana tabacum;NtJAZ1;Gene editing;Nicotine;Glandular trichome;Aphid resistance烟碱占烟草生物碱含量的90%95%1，其在烟株中的作用主要是调节烟叶品质和抵御害虫侵食 2-3。烟草植株表面覆盖着大量表皮毛，其分泌物主要成分为西柏烷类二萜和蔗糖酯化合物，这些成分不仅是重要的香气前体物质，而且对蚜虫具有明显的趋避作用4-6。因此，提高烟叶烟碱含量及叶面化学成分含量对改善烟叶品质和增强蚜虫抗性具有重要意义。茉莉酸（Jasmonate acid，JA）是调控植物生长发育、应答多种胁迫反应的重要信号分子7，茉莉酸ZIM结构域（Jasmonate zim domain，JAZ）蛋白是JA信号途径中关键的转录抑制因子8，可以响应JA的刺激，在SCFCOI1复合物作用下被26S蛋白酶体降解，释放结合的MYC2转录因子，从而启动JA应答基因的转录9-10。在野生烟草中，JAZ沉默株系上调JA响应基因，可增强对烟草天蛾的抗性11。拟南芥JAZ1基因在低温条件下能激活植株的次生代谢，提高植株的耐寒性，维持植株正常的生长发育和物质代谢12-13。Zhang等14-15的研究表明，NtJAZ1基因可调控烟草中烟碱的生物合成，为通过敲除NtJAZ1基因来提高烟草中烟碱含量提供了可能。郑淑心等16对K326品种NtJAZ1基因进行编辑，发现NtJAZ1基因敲除后烟株烟碱含量显著提高，但叶面腺毛密度及叶面化学成分含量有所降低。说明NtJAZ1的功能缺失可促进烟碱生物合成，同时对腺毛发生也有一定影响。Y2001作为高分泌型突变品系，具有产量高、生育期短、易烘烤的特点，且长柄腺毛密度及分泌物含量也较高17，在豫中烟区颇受青睐。为进一步提高Y2001的品质和抗性，彰显其浓香型风格特色，利用基因编辑技术对Y2001中的烟碱负调控基因NtJAZ1进行敲除，研究了NtJAZ1敲除对烟株发育、烟碱生物合成、腺毛发育和腺毛分泌物积累以及蚜虫抗性的影响，旨在为Y2001品系的品质改良奠定基础。1材料与方法1.1材料供试材料为Y2001，幼苗培养于光照培养箱中，培养条件为25、相对湿度60%，光暗交替，16 h光照、8 h黑暗。1.2方法1.2.1NtJAZ1基因载体构建根据茄科基因组网站（https：/ 发 表 的 烟 草 NtJAZ1 基 因 序 列 Nitab4.5_0000073g0270.1（NtJAZ1a）、Nitab4.5_0004234g0080.1（NtJAZ1b），利用 CRISPR2 在线软件（http：/ bp，下划线标注为PAM区），合成二聚体后构建 NtJAZ1 基因敲除载体（pCBSG012-JAZ1）（图1）。图1NtJAZ1基因敲除载体示意图Fig.1Diagram of NtJAZ1 knockout Vector1.2.2遗传转化采用叶盘转化法18进行烟草遗传转化。将载体转化到大肠杆菌DH5感受态细胞中，涂布于抗性培养基上，挑选单菌落进行菌液PCR检测，检测后提取质粒将其转化到根癌农杆菌EHA105中，于YEB培养基上培养至菌液OD600值为0.40.6时用于共培养转化。将Y2001的无菌叶片剪成0.8 cm0.8 cm的小片，置于MS培养基上进行暗培养，48 h后将其转移至活化的含有农杆菌菌液的YEB培养基中侵染8min，并及时吸干叶片表面残留的菌液，放置于含有潮霉素的筛选培养基（MS+Cef 0.500 00 g/L+Hyg0.006 00 g/L+6-BA 0.001 00 g/L+NAA 0.000 15g/L）中，未用农杆菌侵染的叶片分别置于含有潮霉素和不含潮霉素的培养基上作为对照1和对照2，待经农杆菌侵染的叶片长出不定芽后转入生根培养基（MS+Hyg 0.008 00 g/L+NAA 0.000 10 g/L）中继续 2第 56 卷第 9 期培养，待长出较为茂密的根系时移栽至室内基质土中继续培养获得转基因植株，并将其命名为HN。1.2.3分子鉴定通过 CTAB 法提取所得转基因植株的基因组DNA，提取的 DNA 用 NtJAZ1 特异性引物（F1：5-CTAGGAAAGGCTAAAAAGAAACAGT-3；R1：5-CTGATATGGTGCAGTTGAAGTA-3）进行 PCR 扩增。PCR反应条件：94 预变性5 min；94 变性30 s，56.5 退火 30 s，72延伸 30 s，35 个循环；72 延伸10 min，最后4 保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送至深圳华大基因股份有限公司进行序列测定，将测序结果与茄科基因组网站中的NtJAZ1基因序列进行比对，筛选出纯合突变单株。将测定出来的纯合突变单株进行自交并收获得到T1代烟草种子。1.2.4烟碱含量测定选取六叶一心期烟苗叶片和根系进行总生物碱含量测定。将烟叶和根系放入105 烘箱中烘30min进行杀青处理，于60 烘至恒质量。烘干后用碾子研磨粉碎，过直径为0.25 mm的过滤筛。准确称取0.2 g粉末倒入15 mL试管中，加入100 L烟碱内标，1.5 mL10%NaOH 溶液和 3 mL 甲基叔丁基醚，密封后充分振荡5 min。室温放置（24 2）h后，取上清溶液进行GC-FID分析。1.2.5烟碱合成相关基因表达量测定利用植物总RNA提取试剂盒（DP4332，天根生化科技有限公司）分别提取Y2001和HN的根系总RNA，利用反转录试剂盒（NovoScriptII ReverseTranscriptase，上海近岸科技有限公司）反转录为cDNA。根据NCBI GenBank中的烟碱合成相关基因（NtMYC2a、NtMYC2b、NtPMT、NtQPT、NtODC 和NtA622）序列，利用Primer Premier 5.0软件设计荧光定 量 PCR 引 物，上、下 游 引 物 见 表 1，以 NtL25（L18908）为内参基因。RT-PCR反应程序：95 预变性10 min；95 变性10 s，58 退火30 s，72 延伸30 s，40个循环；熔解曲线：95 15 s，58 15 s，20 min内升至95，95 15 s。采用2-CT法计算相关基因的相对表达量，设置3次重复。1.2.6腺毛形态观察于烟苗十叶一心期分别取Y2001和HN长度约为10 cm的叶片用于腺毛观察，试验操作参考娄亚楠等19的方法，将叶片置于0.2%的罗丹明 B水溶液中浸染30 min，染色结束后用蒸馏水漂洗干净，冲洗叶片表面未结合的染料。用滤纸轻轻吸干叶片表面水分后置于超景深显微镜（VHR-5000，日本基恩士公司）下进行腺毛观察，并在观察时随机选择3个视野对长柄分泌型腺毛、短柄分泌型腺毛及非分泌型表皮毛的密度进行统计。1.2.7叶面化学成分分析于烟苗十叶一心期分别挑选Y2001和HN各5株长势良好的烟苗，用直径5 cm打孔器打取20个叶圆片，用二氯甲烷进行浸提。浸提时向浸提液中加入 1 mL 内标（2.020 mg/mL 的蔗糖八乙酸酯和2.542 mg/mL的正十七烷醇），然后加入10 g左右无水硫酸钠除水，定量滤纸过滤。将过滤后的溶液进行旋转蒸发，得到浓缩液后用氮气吹干。加入500 L V（DMF）V（BSTFA）=11 的溶液，于75 水浴中进行衍生化反应60 min，然后加入N,O-双乙酰胺和吡啶各125 L。得到的样品通过GC/MS分析仪（色谱仪型号HP-5890，质谱仪型号vc-70SE，美国Agilent公司）进行叶面化学成分的定性和定量分析，色谱参数检测参考王霄龙等20的方法。1.2.8蚜虫抗性分析活体植株蚜虫选择试验：参考孙计平等21的方法并稍加修改。分别选取六叶一心期长势一致的烟苗Y2001和HN各3株，均匀放置于蚜虫培养箱内，每天2000时调查并记录烟苗上蚜虫的数量，连续调查7 d。基因NtMYC2aNtMYC2bNtPMTNtQPTNtODCNtA622NtL25登录号XM_016647274.1XM_016643776.1XM_016622537.1XM_016656560.1XM_016641574.1XM_016605924.1L18908上游引物（5 3）TCACCCATTTCTCTCTCTCTCTCTCACCTATTTCTCTCCTCCTCTCAAAATGGCACTTCTGAACACTTGATCAATGGGAGGTTTGAGTTTCCGACGACTGTGTTTGGATGGAAATCCCAAAGCAATCCCCTCACCACAGAGTCTGC下游引物（5 3）GAGGTAACAGCAGCAGTAGTAGGTAACAGCAGCAACAGCAGTAGCCAGGCTTAATAGAGTTGGATCAGGGCACCACTAGAAATGATTGGACCCAGCAGCTTTAGGCAGGTGGTCTCATGTGAAGTTCTAACTCCTGTTGTTGTGGGAA表1引物序列Tab.1Primer sequences used in this study侯子航，等：NtJAZ1基因敲除对烤烟Y2001烟碱合成和腺毛发育的影响 32023 年烟草科技离体叶片蚜虫选择试验：采用叶碟法22分别选取六叶一心期长势一致的Y2001和HN烟苗叶片各3片，均匀放置于直径约25 cm的培养皿中。并在培养皿底部铺设一层带水的脱脂棉，以保持叶片活性。在培养皿中间放置100只饥饿2 h的蚜虫，每隔2 h统计不同株系叶片上蚜虫的数量，计数5次，共10 h。1.2.9数据处理试验均设置 3 次生物学重复，所获得的数据采用 SPSS17 软件进行独立样本 T 检验和显著性检 验，使 用 GraphPad Prism 8.4.3 软 件 进 行 图 表绘制。2结果与分析2.1NtJAZ1基因敲除材料的创制与分子鉴定采用农杆菌介导法，将构建好的NtJAZ1基因敲除载体转化Y2001，获得了56株耐受潮霉素的阳性植株（图 2）。提取阳性植株叶片的总 DNA，利用NtJAZ1特异性引物进行PCR扩增并测序，有12株在gRNA 区域检测到序列突变，基因编辑效率为21.43%。其中有1株烟苗的NtJAZ1基因序列发生碱基纯合突变，NtJAZ1a和NtJAZ1b均在253254 bp处插入1个A碱基，导致NtJAZ1基因功能缺失，并将其命名为HN（图3）。图2NtJAZ1基因敲除载体的遗传转化Fig.2Genetic transformation of NtJAZ1 knockout vectorA.对照1B.对照2C.侵染叶片D.再生植株2.2NtJAZ1基因敲除对腺毛发育的影响对敲除植株苗期形态及腺毛发育进行观察，结果如图 4A、4B 所示。从图 4 中可以发现，HN 和Y2001在苗期形态上差异并不显著，说明NtJAZ1基因敲除不会影响植株苗期的正常生长发育。与Y2001相比，HN腺毛密度显著降低，其中腺毛总密度降低14.92%，长柄分泌型腺毛密度降低19.46%，但长柄分泌型腺毛腺头更加饱满且着色更深。非分泌型保护毛密度略有下降但变化不显著，短柄分泌型腺毛密度基本不变。说明NtJAZ1基因敲除显著降低了植株叶面腺毛密度，尤其是长柄分泌型腺毛的密度。图3Y2001和部分突变株系测序峰图Fig.3Sequencing peak maps of Y2001 and the mutant plants 4第 56 卷第 9 期B侯子航，等：NtJAZ1基因敲除对烤烟Y2001烟碱合成和腺毛发育的影响图4Y2001和HN腺毛形态观察Fig.4Trichome morphology observation of Y2001 and HN*表示差异达到显著（P 0.05）水平，*表示差异达到极显著（P 0.01）水平。下同。A.植株与腺毛（200）形态及局部放大图B.不同类型的腺毛密度A2.3NtJAZ1基因敲除对叶面化学成分的影响分别对Y2001和HN进行叶面化学成分测定，结果如图5A、5B所示。与Y2001相比，HN分泌物组分无明显改变，均含西柏烷类、烷烃和蔗糖酯等物质。另外，HN 分泌物总量以及各组分含量与Y2001间差异均不显著。说明NtJAZ1基因敲除不会影响植株叶面化学成分的组分和含量。虽然NtJAZ1基因敲除降低了叶面的腺毛密度，但同时也提高了腺毛的分泌能力，导致叶面化学成分含量无显著变化。2.4NtJAZ1基因敲除对烟苗生物碱合成的影响分别选取六叶一心期的烟苗叶片与根系进行生物碱含量测量，结果如图6A所示。与Y2001相比，HN叶片中生物碱总量和烟碱含量分别提高20.54%和19.38%，变化达到极显著水平，其余物质变化不显著；根系中 HN 生物碱总量和烟碱含量分别提高30.94%和30.85%，变化达到极显著水平，其余物质变化不显著。说明NtJAZ1基因敲除可促进植株烟 52023 年烟草科技图6Y2001和HN在幼苗时期叶片和根系生物碱含量及根系烟碱相关基因表达分析Fig.6Alkaloid contents in leaves and roots and root nicotine-related gene expression analysis of Y2001 and HN seedlingsA.幼苗时期叶片和根系的生物碱含量变化B.根系烟碱相关基因表达分析碱的合成，且在根系中表现更为明显。根系烟碱相关合成基因表达量分析结果如图6B所示。与Y2001相比，HN中NtMYC2a、NtMYC2b、NtPMT 和 NtQPT 的相对表达量均极显著提高，而NtODC和NtA622的相对表达量无显著变化。说明在敲除NtJAZ1基因后影响了JA途径中烟碱合成相关基因的表达，进而影响植株烟碱的合成。2.5NtJAZ1基因敲除对植株蚜虫抗性的影响活体植株蚜虫选择试验结果如图 7A 和 7B 所示。Y2001叶片下表面上的蚜虫密度明显高于HN，图5Y2001和HN叶面化学成分分析Fig.5Analysis of leaf surface chemical composition of Y2001 and HNA.叶面化学成分分析质谱图B.叶面化学成分含量 6第 56 卷第 9 期A.活体植株蚜虫吸食叶片下表面情况B.活体植株蚜虫数量统计C.离体叶片蚜虫吸食叶片情况D.离体叶片蚜虫数量统计图7Y2001和HN的蚜虫抗性分析Fig.7Analysis of aphid resistance of Y2001 and HN侯子航，等：NtJAZ1基因敲除对烤烟Y2001烟碱合成和腺毛发育的影响在7 d内Y2001叶片上的蚜虫数量极显著高于HN，第7天时Y2001叶片上的蚜虫数量达到最大值，HN的平均蚜虫数量比Y2001减少28.25%。离体叶片蚜虫选择试验结果如图7C、7D所示。在接种2、4、6、8、10 h时，Y2001上的蚜虫数量均极显著高于 HN，HN 的平均蚜虫数量比对照减少47.19%。表明HN在不同处理条件下蚜虫数量均极显著低于Y2001，说明NtJAZ1基因敲除后可显著提高植株对蚜虫的抗性。3讨论烟草生物碱对烟叶品质和烟株抗性有重要影响23。通过对烤烟品种K326中NtJAZ1基因进行编辑，创制了高烟碱K326材料，明确了NtJAZ1基因敲除可显著提高烟株烟碱含量，虽对植株形态没有明显影响，但其腺毛密度有所下降，暗示NtJAZ1对腺毛发生具有一定影响16。烟草腺毛发育受茉莉酸信号的诱导24，但NtJAZ1基因在其中的作用尚不明确。本试验中采用CRISPR/Cas9技术对Y2001中NtJAZ1基因进行敲除，经过遗传转化和分子鉴定后，获得了纯合突变株系HN。发现Y2001和HN在苗期植株表型上并无明显差异，说明NtJAZ1基因敲除不会影响植株苗期的正常生长发育，这与荆叶醒25对小麦TaJAZ1基因编辑后植株生长发育状况良好的结果一致。对烟草Y2001和HN幼苗的叶片和根系进行烟碱含量检测，发现叶片中HN烟碱含量提高19.38%，根系中HN烟碱含量提高30.85%。对NtJAZ1基因敲除后根系中烟碱相关基因的表达分析发现，烟碱合成相关基因NtMYC2a、NtMYC2b、NtPMT和NtQPT等的表达量均极显著增加，说明NtJAZ1基因敲除后影响了植株根系的JA信号转导途径，使JA信号下游烟碱合成基因表达量提高，从而导致HN植株中烟碱含量显著增加，且根系中烟碱含量明显高于叶片，这与胡国松等26的研究结果一致。对Y2001与HN腺毛密度及叶面化学成分分析表明，与Y2001相比HN的总腺毛密度和长柄分泌型腺毛密度均有所降低，这与郑淑心等16的研究结果一致。但其腺头明显变大且染色更深，叶面化学成分组分与含量与Y2001间差异不明显。说明NtJAZ1基因敲除后会降低腺毛密度，但会使腺毛的分泌能力有所提高，导致叶面化学成分含量不受基因缺失的影响。由此推测，NtJAZ1对腺毛的物质代谢具有一定的促进作用，但其中的分子机制还有待进一步研究。另外，在本研究中通过蚜虫接种试验发现，HN在蚜虫抗性方面明显优于Y2001。其中，活体植株蚜虫选择试验中接种蚜虫7 d后HN上的平均蚜虫 72023 年烟草科技数量比Y2001减少28.25%，离体叶片蚜虫选择试验中HN上的平均蚜虫数量比Y2001减少47.19%，均达极显著水平。说明NtJAZ1基因敲除后可明显提高烟草幼苗对蚜虫的抗性，但其对田间蚜虫及其他病虫害的抗性如何还有待进一步试验验证。4结论通过CRISPR/Cas9技术敲除高分泌型烤烟品种Y2001 中的 NtJAZ1 基因获得了纯合株系 HN。对HN株系进行室内研究发现，NtJAZ1基因敲除后植株腺毛密度显著降低，分泌物含量无显著变化，说明NtJAZ1基因敲除对腺毛发生有一定的抑制作用，但显著提高了腺毛的分泌能力。同时对植株的烟碱合成能力有明显促进作用，使根系中烟碱含量显著提高，植株对蚜虫的抗性也显著增强。因此NtJAZ1基因是进行烟草品质和抗性改良的重要靶点之一。参考文献1 SiminszkyB,GavilanoL,BowenSW,etal.Conversion of nicotine to nornicotine in Nicotianatabacum is mediated by CYP82E4,a cytochrome P450monooxygenase J.ProceedingsoftheNationalAcademy of Sciences of the United States of America,2005,102（41）：14919-14924.2 徐宜民，王树声，赖禄祥，等.烟草生物碱的研究现状J.中国烟草科学，2003，24（2）：12-16.XU Yimin，WANG Shusheng，LAI Luxiang，et al.Review of the studies of tobacco alkaloids J.ChineseTobacco Science，2003，24（2）：12-16.3Steppuhn A，Gase K，Krock B，et al.Nicotine sdefensive function in natureJ.PLoS Biology，2004，2（8）：e217.4Johnson A W，Severson R F，Hudson J，et al.Tobaccoleaf trichomes and their exudates J.Tobacco Science，1985，29：67-72.5 Wang 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