23-乙酰泽泻醇改善脂多糖诱导的急性肺损伤的作用机制.pdf

基金项目:湖北省中央引导地方科技发展专项项目(2019ZYYD065);湖北省自然科学基金青年科学基金资助项目(2022CFB671)作者单位:430060武汉大学人民医院急诊科(李文),药学部(宋杨一嫣、宋金春)通信作者:宋杨一嫣,电子信箱:919572095 23-乙酰泽泻醇改善脂多糖诱导的急性肺损伤的作用机制李文宋杨一嫣宋金春摘要目的探讨 23-乙酰泽泻醇对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的急性肺损伤的作用机制。方法 8 10 周龄C57BL6J 雄性小鼠 24 只,体质量为 23.5 27.5g,将其按照随机数字表法分为对照组、模型组(LPS 组)、23-乙酰泽泻醇组、LPS+23-乙酰泽泻醇组,每组各 6 只。小鼠气管内注射 200g LPS 诱导急性肺损伤模型;采用苏木精-伊红(hematoxylin-eo-sin,HE)染色、肺脏湿重/干重比值和炎性指数评价急性肺炎程度;采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒检测促炎性细胞因子肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor-,TNF-)、白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的水平;采用试剂盒检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶 2(mito-chondrial superoxide dismutase2,SOD2)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,Gpx)的水平/活性;采用 Western blot 法检测相关信号分子的改变。结果HE 染色结果显示,LPS 组小鼠肺组织炎性浸润明显增多,肺脏湿重/干重比值和炎性指数高于对照组;LPS 组小鼠肺脏组织中 TNF-、IL-1 和 IL-6 的水平明显高于对照组;LPS 组小鼠的 ROS 和 MDA 含量高于对照组,SOD2 和 Gpx 的活性明显低于对照组。LPS+23-乙酰泽泻醇组小鼠的肺脏湿重/干重比值和炎性指数低于 LPS 组;炎性细胞因子的水平低于 LPS 组;ROS 和 MDA 含量低于 LPS 组。但是 SOD2 和 Gpx 的活性明显高于 LPS 组。Western blot 法检测结果显示,LPS 组小鼠肺脏组织中 JNK1/2 显著上调,P-ERK1/2 明显增加;而 LPS+23-乙酰泽泻醇组肺脏组织中 JNK1/2 和 P-ERK1/2的表达低于 LPS 组。结论 23-乙酰泽泻醇可以通过抑制 JNK1/2-ERK1/2 减轻 LPS 诱导的急性肺损伤。23-乙酰泽泻醇可能成为治疗急性肺损伤的治疗手段。关键词 23-乙酰泽泻醇脂多糖急性肺损伤ERK1/2中图分类号R974文献标识码ADOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2023.07.012Mechanism of23-Acetyl Alisalol Ameliorates Lipopolysaccharide-induced Acute Lung Injury.LI Wen,SONG Yangyiyan,SONG Jin-chun.Department of Emergency,Renmin Hospital of Wuhan University,Hubei 430060,ChinaAbstractObjective To investigate themechanism of 23-acetylalismol on acute lung injury induced by lipopolysaccharide(LPS).MethodsC57BL6J male mice 24 aged 8 to 10 weeks with body weight of 23.5 to 27.5g were randomly divided into 4groups:control group,model group(LPS group),23-acetylalismol group,LPS+23-acetylalismol group.Acute lung injury model was inducedbyintratracheal injection of 200g LPS;hematoxylin-eosin(HE)staining,lung wet weight/dry weight ratio and inflammation index wereused to evaluate the degree of acute pneumonia.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)kit was used to detect pro-inflammatoryfactors,tumor necrosis factor-(TNF-),interleukin-1(IL-1)and interleukin-6(IL-6)levels.Malondialdehyde(MDA),reactive oxygen species(ROS),superoxide dismutase 2(SOD2)and glutathione reductase(Gpx)levels/activity were detected by kits.The changes of relevant signal molecules were detected by Western blot.ResultsHE staining showed that the inflammatory infiltration de-tails of lung tissues increased significantly in the LPS group,and the wet weight/dry ratioweightand inflammation index of the lungs werehigher than those in the control group;the levels of TNF-,IL-1 and IL-6 in the lung tissues of the LPS group were significantlyhigher than those of the control group:The content of ROS and MDA in the LPS group was higher than that of the control group,and theactivities of SOD2 and Gpx were significantly lower than that of the control group.The wet weight/dry weight ratio and inflammation indexof lungs in the LPS+23-acetyl-alismanol group were lower than those of the LPS group;the levels of inflammatory factors were lowerthan those of the LPS group;and the levels of ROS and MDA were lower than those of the LPS group.However,the activities of SOD2and Gpx were significantly higher than that of the LPS group.Western blot analysis showed that JNK1/2 and P-ERK1/2 were significant-65论著J Med Res,July 2023,Vol.52 No.7ly up-regulated in lung tissues of LPS group;while reduced in the LPS+23-acetylalismol group.Conclusion23-acetyl alismaolcould reduce the LPS-induced acute lung injury by inhibiting JNK1/2-ERK1/2.23-acetyl alismaol may become a treatment methodfor the treatment of lung injury caused by infection.Key words 23-acetyl alismanol;Lipopolysaccharide;Acute lung injury;ERK1/2由败血症、细菌感染和病毒性肺炎以及外伤引起的急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)的主要原因,其特征是严重的低氧血症和双侧肺渗透性损伤1。在 ARDS 的发生、发展过程中,肺泡毛细血管内皮细胞损伤导致屏障通透性增加,引起大量水肿和炎性液体渗入肺泡腔,减弱气体交换,最终导致呼吸衰竭2,3。虽然肺保护性通气策略的应用降低了 ALI 的病死率,但目前临床上还没有治疗 ALI 的有效药物。因此,深入了解 ALI 的病理学、寻找新的治疗靶点具有重要意义。多项研究证实,植物甾醇具有抗炎、保肝、降脂等作用4。23-乙酰泽泻醇是植物甾醇的衍生物,从药用植物 Alisson 中提取和分离4。23-乙酰泽泻醇可降低脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的心功能不全小鼠血浆中白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)和肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor-,TNF-)的水平,减 轻 心 肌 炎 症 和 浸 润,改 善 模 型 小 鼠 的 存 活率5。23-乙酰泽泻醇可通过预防小鼠非酒精性脂肪性肝炎和胆汁淤积性肝损伤6。然而,23-乙酰泽泻醇在调节肺损伤中的作用方式和机制尚未完全阐明。为了进一步探索 23-乙酰泽泻醇的药理作用和潜在机制,本研究通过 LPS 气管内注射建立 ALI 模型,并研究 23-乙酰泽泻醇对肺损伤的作用机制。材料与方法1.材料:TNF-、IL-1 和 IL-6 的酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒购自英国 Abcam 公司。LPS 购自美国 Sigma-Aldrich 公司。针对 JNK1/2、磷酸化(P-)ERK1/2、总(T-)ERK1/2 和 GAPDH 的抗体购自美国 CellSignaling Technology 公司。C57BL6J 小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司。23-乙酰泽泻醇购自成都普瑞法科技开发有限公司。2.实验动物:8 10 周龄 C57BL6J 雄性小鼠 24只(体质量为 23.5 27.5g)购自中国医学科学院/北京协和医学院。动物实验按照武汉大学人民医院动物护 理 和 使 用 委 员 会 批 准(许 可 证 号:WHDX-RM20191203)。将其按照随机数字表法分为 4 组,每组各 6 只。(1)对照组:支气管注射 20l 无菌 0.9%氯化钠溶液。(2)23-乙酰泽泻醇组:在模型建立前3 天,小鼠灌胃接受 30mg/kg 23-乙酰泽泻醇,每天 1次,共 3 次。随后接受单次支气管注射 20l 无菌0.9%氯化钠溶液,48h 后取材。(3)LPS 组:接受单次支气管注射 20l 100g LPS,48h 后取材。(4)LPS+23-乙酰泽泻醇组:在模型建立前 3 天,小鼠灌胃接受 30mg/kg 23-乙酰泽泻醇,每天 1 次。随后接受单次支气管注射 20l 100g LPS,48h 后取材。LPS 组和 LPS+23-乙酰泽泻醇组小鼠 LPS 注射 48h 后,用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)灌注肺 3 次,并收集灌注溶液。3.苏木精-伊红(HE)染色:LPS 注射 48h 后取出肺组织,10%甲醛溶液固定,石蜡包埋,切成 25m的切 片。进 行 HE 染 色 后,使 用 显 微 镜(OlympusBX53,日本产,购自上海赖氏电子科技有限公司)进行观察肺组织的病理变化。为了评估肺炎性指数,每只小鼠评估 7 个独立的随机肺野并计数下列指标:A:肺泡空间中的中性粒细胞;B:间隙中的中性粒细胞;C:透明膜;D:充满肺泡的蛋白质碎片;E:根据美国胸科学会官方研讨会报告关于动物实验性 ALI 的特征和测量的相关性,肺炎性指数=(20 A)+(14 B)+(7 C)+(7 D)+(2 E)/(肺野数 100)9。4.肺水肿的测定:收集左肺并称重以记录湿重。肺在 80下烘烤 48h 后记录干重。湿重/干重(%)=湿重/干重 100%。5.ELISA 检测肺泡灌洗液中的炎性细胞因子:通过使用 ELISA 试剂盒对 TNF-、IL-1 和 IL-6进行定量测定(均购自美国 Biolegend 公司),检测ALI 小鼠支气管肺泡灌洗液中促炎性细胞因子水平。裂解组织样品和细胞样品。然后将裂解物在相应的板中温育。洗涤后,加入抗体,样品在室温下孵育 1h。洗涤后,加入辣根过氧化物酶偶联的IgG 并在室温下孵育 1h。加入 150l 底物,采用酶标仪(美国 BioTek Synergy HT 公司)测定 405nm 处的吸光度值。75医学研究杂志 2023 年 7 月第 52 卷第 7 期论著6.氧化应激测定:采用 2,7-二氯二氢荧光素(DCFH-DA)探针(上海 Beyotime 公司)测定活性氧(reactive oxygen species,ROS)的水平,采用酶标仪检测 450nm 处的光密度值。使用试剂盒检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平,超氧化物歧化酶(mi-tochondrial superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,Gpx)的活性(上海Beyotime 公司)。7.Western blot 法检测:采用放射免疫沉淀测定裂解缓冲液(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解细胞,检测总蛋白浓度,然后将样品加载到聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶上。将蛋白转移到聚偏二 氟乙烯膜(HATF00010,美 国 Millipore 公司)后,将膜与磷酸化的(P-)和总的(T-)应激活化蛋白激酶 1/2(Jun N-terminal kinase,JNK1/2)、磷酸化的细胞外调节激酶 1/2(phosphorylation extracel-lular signal-regulated-kinase1/2,P-ERK1/2)、总的 ERK1/2(T-ERK1/2)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAP-DH)一抗孵育过夜(均以 1 1000 稀释)。用增强化学发光试剂(美国 Bio-Rad 公司),并由 ChemiDocMP 成像系统(美国 Bio-Rad 公司)捕获信号。采用GAPDH 作为内参。8.统计学方法:应用 SPSS 23.3 统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数 标准差(x s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,事后多重比较方法采用 Tukey 检验,以 P 0.05 为差异有统计学意义。结果1.23-乙酰泽泻醇减少 LPS 诱导的肺损伤:HE染色结果显示,与对照组比较,LPS 组小鼠肺组织损伤表现为充血、炎性细胞浸润水肿和肺泡间隔增厚。LPS+23-乙酰泽泻醇组小鼠肺组织损伤程度低于LPS 组,表现为炎性细胞浸润、间隙增厚明显缓解(图 1)。图 1 23-乙酰泽泻醇减少 LPS 诱导的肺损伤(HE 染色)2.23-乙酰泽泻醇减少 LPS 诱导的肺水肿和炎症损伤:LPS 组小鼠肺脏湿重/干重明显高于对照组(P 0.05),而 LPS+23-乙酰泽泻醇组小鼠肺组织湿重/干重比值低于 LPS 组(P 0.05),提示肺水肿程度低于模型组。LPS 组小鼠肺脏炎性指数高于对照组(P 0.05);LPS+23-乙酰泽泻醇组小鼠肺组织炎性指数低于 LPS 组(P 0.05)。3.23-乙酰泽泻醇减少肺泡灌洗液中炎性细胞因子的分泌:ELISA 检测肺泡灌洗液中炎性细胞因子的水平发现,LPS 组小鼠肺泡灌洗液中 TNF-、IL-图 2 23-乙酰泽泻醇减少 LPS 诱导的肺水肿和炎症损伤与对照组比较,P 0.05;与 LPS 组比较,#P 0.0585论著J Med Res,July 2023,Vol.52 No.71、IL-6 含量高于对照组(P 0.05),而 LPS+23-乙酰泽泻醇组小鼠肺泡灌洗液中 TNF-、IL-1、IL-6 低于 LPS 组(P 0.05)。图 3 23-乙酰泽泻醇减少肺泡灌洗液中炎性细胞因子的分泌与对照组比较,P 0.05;与 LPS 组比较,#P 0.05 4.23-乙酰泽泻醇减少 LPS 诱导的氧化应激:LPS 组小鼠 ROS 水平和 MDA 含量高于对照组(P 0.05),而 LPS+23-乙酰泽泻醇组小鼠肺组织中ROS 水平和 MDA 低于 LPS 组(P 0.05)。LPS 组小鼠肺脏 SOD2 和 Gpx 活性低于对照组(P 0.05);LPS+23-乙酰泽泻醇组小鼠肺组织中 SOD2 和 Gpx活性高于 LPS 组(P 0.05)。图 4 23-乙酰泽泻醇减少 LPS 诱导的氧化应激与对照组比较,P 0.05;与 LPS 组比较,#P 0.055.23-乙酰泽泻醇抑制 JNK1/2 和 ERK1/2 通路:Western blot 法检测结果显示,LPS 组小鼠 P-JNK1/2 表达水平和 P-ERK1/2 表达水平高于对照组(P 0.05),而 LPS+23-乙酰泽泻醇组小鼠肺组织中 P-JNK1/2 和 P-ERK1/2 低于 LPS 组(P 0.05,图 5、表 1)。讨论细胞损伤、炎症激活等复杂因素共同促进 ALI/ARDS 的发病2。这一过程涉及多种细胞,包括肺泡上皮细胞、肺内皮细胞以及各种炎性细胞,如中性粒细胞和肺泡巨噬细胞3。肺血管内皮细胞在肺组织发育、肺组织免疫、维持肺血管张力和屏障完整性中起关键作用1。在 ALI/ARDS 病理过程中,肺血管内皮是最先暴露于病理刺激的基础细胞。肺血管内皮损伤导致 ALI/ARDS 的发生和进一步发展1。既往研究报道,23-乙酰泽泻醇可降低 LPS 诱导的心功能不全小鼠血浆中 IL-6、IL-1 和 TNF-的水平,减轻心肌炎症和浸润,改善模型小鼠的存活率5。23-95医学研究杂志 2023 年 7 月第 52 卷第 7 期论著图 5 23-乙酰泽泻醇抑制 JNK1/2 和 ERK1/2 通路表 1 23-乙酰泽泻醇抑制 JNK1/2 和 ERK1/2 通路(x s)组别nP-JNK1/2/T-JNK1/2P-ERK1/2/T-ERK1/2对照组60.82 0.121.39 0.1323-乙酰泽泻醇组60.81 0.121.44 0.17LPS 组61.40 0.082.84 0.34LPS+23-乙酰泽泻醇组61.00 0.06#1.95 0.09#F35.72350.901P 0.001 0.001与对照组比较,P 0.05;与 LPS 组比较,#P 0.05乙酰泽泻醇可通过预防小鼠非酒精性脂肪性肝炎和胆汁淤积性肝损伤6。本研究结果发现,23-乙酰泽泻醇可抑制 ALI 的进展。23-乙酰泽泻醇保护 LPS刺激的肺损伤,减轻炎性反应和氧化应激。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase,MAPK)被生长因子、促炎性细胞因子和压力等多种因素激活,在细胞发育、存活、死亡、炎症等方面发挥着重要作用10。MAPK 包含 ERK1/2、JNK1/2、P38 和 ERK5。MAPK 通路可介导炎症、细胞死亡和氧化应激11。在 ALI 中,ERK1/2 在肺泡内皮细胞中的表达上调,导致 ROS 的产生增加12。此外,一旦ERK1/2 被磷酸化激活,可不断诱导促凋亡蛋白 Bax和 caspase-3 的 表 达 和 激 活,促 进 细 胞 凋 亡 的 发生12。研究还发现,ERK1/2 的激活可以促进炎症级联反应,抑制 ERK1/2 可以减少 ALI 病理过程中炎性介质的释放13,14。JNK 主要由促炎性细胞因子以及应激通过凋亡信号调节激酶 1(apoptosis signal-regu-lating kinase 1,ASK1)、转化生长因子激酶 1(transfor-ming growth factor kinase 1,TAK1)自身的磷酸化激活10,15。研究证明,抑制 ALI 小鼠中的 MAPK 可减轻炎症和氧化应激16。既往研究发现,23-乙酰泽泻醇可以作用于 Toll 样受体信号途径5,17。然而本研究发现,23-乙酰泽泻醇可同时作用于肺脏组织的ERK1/2 和 JNK1/2,抑制 ERK1/2 和 JNK1/2 的激活,从而改善 LPS 诱导的 ALI。综上 所 述,23-乙 酰 泽 泻 醇 通 过 同 时 作 用 于ERK1/2 和 JNK1/2 通路的激活来抑制和改善 LPS 诱导的 ALI。23-乙酰泽泻醇可能成为治疗 ALI/ARDS的新策略。参考文献1 王倩,明婷倩,吴晓静.铁死亡的发生机制及其在急性肺损伤的研究进展J.医学研究杂志,2022,51(6):173-1762 郑凤霞,刘迪,张莉红.白藜芦醇治疗脓毒症大鼠急性肺损伤的作用及机制研究 J.医学研究杂志,2020,49(1):141-1443 瞿利花,陈超,陈阳晔,等.自噬在急性肺损伤炎症中的研究进展J.医学研究杂志,2019,48(6):14-174 Yu XC,Fu Y,Bi YH,et al.Alisol B 23-acetate activates ABCG5/G8 in the jejunum via the LXRalpha/ACAT2 pathway to relieve ather-osclerosis in ovariectomized ApoE(-/-)miceJ.Aging:AlbanyNY,2020,12(24):25744-257665 Wang B,Chen L,Dai L,et al.Alisol B 23-acetate ameliorates li-popolysaccharide-induced cardiac dysfunction by suppressing toll-like receptor 4(TLR4)/NADPH oxidase 2(NOX2)signaling path-wayJ.Med Sci Monit,2019,25(1):8472-84816 Meng Q,Duan XP,Wang CY,et al.Alisol B 23-acetate protects a-gainst non-alcoholic steatohepatitis in mice via farnesoid X 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