OsGA3ox通过合成不同活性GA调控水稻育性及株高.pdf

Hereditas(Beijing)2023 年 9 月,45(9):845855 收稿日期:20230315;修回日期:20230614;网络发布日期:20230719 基金项目:国家自然科学基金面上项目(编号：32071930)，湖南省自然科学基金面上项目(编号：2022JJ30421，2021JJ30445)和长沙市自然科学基金项目(编号：kq2014076)资助Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.32071930),the Hunan Province Natural Science Foundation Project(Nos.2022JJ30421,2021JJ30445)and the Changsha City Natural Science Foundation Project(No.kq2014076)作者简介:郝小花，博士，副教授，研究方向：植物生理与分子生物学。E-mail: 通讯作者:李东屏，博士，教授，研究方向：植物生理与分子生物学。E-mail: DOI:10.16288/j.yczz.23-058 研究报告OsGA3ox 通过合成不同活性 GA 调控水稻育性及株高 郝小花1,2，胡爽2，赵丹2，田连福2，谢子靖2，吴莎2，胡文俐2，雷晗2，李东屏2 1.湖南文理学院生命与环境科学学院，植物产品精深加工科技创新团队，常德 415000 2.湖南师范大学生命科学学院，长沙 410081 摘要:赤霉素(gibberellin，GA)是一种重要的激素，参与调控植物多种生长发育过程。GA 生物合成通路已基本阐明，其中赤霉素 3 羟化酶(gibberellin 3-hydroxylase，GA3ox)是多种活性 GA 合成的关键酶。水稻中有 2个 GA3ox 基因(OsGA3ox1 和 OsGA3ox2)，其生理功能虽有初步研究，但它们在合成活性 GA 调控水稻发育过程中是如何分工协作尚不清楚。本研究通过 CRISPR/Cas9 技术获得基因编辑突变体 ga3ox1 和 ga3ox2，发现 ga3ox1花粉育性显著下降，而 ga3ox2 株高显著变矮，表明 OsGA3ox1 是花粉正常发育必需的，而 OsGA3ox2 是茎叶伸长必需的。组织表达分析表明，OsGA3ox1 主要在未开的花中表达，OsGA3ox2 主要在未伸长的叶中表达。进一步对野生型(WT)和两个 ga3ox 突变体未开的花、未伸长的叶及根中的 GA 进行检测分析，发现 OsGA3ox1在花中催化 GA9形成 GA7与花粉育性密切相关；OsGA3ox2 在未伸长的叶中催化 GA20形成 GA1调控株高；OsGA3ox1 在根中催化 GA19形成 GA20，调控 GA3的生成。总之，OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 响应发育信号，在不同组织分工协作合成内源 GA，调控水稻生长和发育。本研究为阐明 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 在 GA 生物合成中的作用以及深入理解 OsGA3ox 的功能提供参考。关键词:水稻；赤霉素；赤霉素 3 羟化酶基因；功能分析 846 Hereditas(Beijing)2023 第 45 卷 OsGA3ox genes regulate rice fertility and plant height by synthesizing diverse active GA Xiaohua Hao1,2,Shuang Hu2,Dan Zhao2,Lianfu Tian2,Zijing Xie2,Sha Wu2,Wenli Hu2,Han Lei2,Dongping Li2 1.Plant Product Deep Processing Technology Innovation Team,College of Life and Environmental Sciences,Hunan University of Arts and Science,Changde 415000,China 2.College of Life Science,Hunan Normal University,Changsha 410081,China Abstract:Gibberellin(GA)is an important hormone,which is involved in regulating various growth and development.GA biosynthesis pathway and synthetase have been basically clarified.Gibberellin 3 hydroxylase(GA3ox)is the key enzyme for the synthesis of various active GA.There are two GA3ox genes(OsGA3ox1 and OsGA3ox2)in rice,and their physiological functions have been preliminarily studied.However,it is not clear how they work together to synthesize active GA to regulate rice development.In this study,the knockout mutants ga3ox1 and ga3ox2 were obtained by CRISPR/Cas9 technology.The pollen fertility of ga3ox1 decreased significantly,while the plant height of ga3ox2 decreased significantly.It shows that OsGA3ox1 is necessary for normal pollen development,while OsGA3ox2 is necessary for stem and leaf elongation.Tissue expression analysis showed that OsGA3ox1 was mainly expressed in unopened flowers,while OsGA3ox2 was mainly expressed in unexpanded leaves.The GA in different tissues of wild type(WT),and two ga3ox mutants were detected.It was found that pollen fertility is most closely related to the content of GA7,and plant height is most closely related to the content of GA1.It was found that OsGA3ox1 catalyzes GA9 to GA7 in flowers,which is closely related to pollen fertility;OsGA3ox2 catalyzes the GA20 to GA1 in unexpanded leaves,thereby regulating plant height;OsGA3ox1 catalyzes the GA19 to GA20 in roots,regulating the generation of GA3.OsGA3ox1 and OsGA3ox2 respond to developmental and environmental signals,and cooperate to synthesize endogenous GA in different tissues to regulate rice development.This study provides a reference for clarifying its role in GA biosynthesis pathway and further understanding the function of OsGA3ox.Keywords:Oryza sativa L.;gibberellin(GA);OsGA3ox;functional analysis 赤霉素(gibberellin，GA)是一类四环二萜类激素，参与高等植物的生长发育过程，如调控株高、种子萌发、雄性育性和免疫等16。GA 在植物、真菌和细菌中都有分布，迄今为止已发现超过 130 种，最为常见的活性形式包括 GA1、GA3、GA4和 GA77。早期研究发现，水稻穗中存在高水平的 GA8。Kobayashi 等9进一步对水稻地上部分和穗中内源GA 的种类和水平的动态变化规律进行研究，发现地上部分 GA19含量最高，GA1、GA20、GA29和 GA53次之；抽穗期的地上部分(含穗)中还发现了 GA34和活性形式的 GA4和 GA7的混合物 GA4/7。GA4/7主要存在花药中，灌浆的种子中少10。雄性不育水稻花药中内源 GA4/7的含量在抽穗前 12 天快速增加，暗示与花粉发育相关11。两系温敏不育系(Norin PL12)在可育条件下，花药中检测到高水平的 GA4/7，而在不育条件下，随着雄性不育性的增加，GA4/7水平显著降低，表明 GA4/7与花药/花粉的发育密切相关12。然而，GA4和 GA7在花药发育，尤其是花粉育性调控中是否都起作用仍不清楚。目前，GA 代谢和信号通路的关键基因已经被鉴定。在 GA 合成中起重要催化活性的酶有 7 种，分别为柯巴基焦磷酸合成酶(ent-copalyl diphosphate synthase，CPS)、贝 壳 杉 烯 合 成 酶(ent-Kaurene synthase，KS)、贝壳杉烯氧化酶(ent-Kaurene oxidase，KO)、贝壳杉烯酸氧化酶(ent-Kaurenoic acid oxidase，KAO)、GA20氧化酶(GA20ox)、GA3羟化酶(GA3ox)第9期 郝小花等:OsGA3ox 通过合成不同活性 GA 调控水稻育性及株高 847 及 GA2氧化酶(GA2ox)13。在 GA 信号通路中，GID1(gibberellin insinsitive dwarf 1)是 GA 的受体蛋白，DELLA 蛋白是 GA 信号抑制因子，GID2 是能泛素化 DELLA 的 E3 泛素连接酶。GA 与 GID1 结合后，能够与 DELLA 结合，通过 26S 蛋白酶体介导的泛素化途径降解 DELLA 蛋白，从而启动 GA 响应基因的表达1416。植物 GA 代谢或信号通路过程中关键基因突变，使得体内活性 GA 水平不足，或GA 信号传递受阻，导致植物生长发育缺陷，如矮化、深绿色小叶、萌发延迟、根生长迟缓、开花延迟、种子减少、雄性育性下降等13,1720。如 SD1 是绿色革命基因，由 OsGA20ox2 编码，其突变体 sd1 呈现半矮杆表型20，d1821、dx22、gid114,15等突变体呈现矮杆表型。活性 GA 的合成依赖于赤霉素 3-羟化酶，水稻中有两个赤霉素 3-羟化酶基因 OsGA3ox1 和OsGA3ox221。OsGA3ox1位于 5号染色体，OsGA3ox2与 D18 基因座等位，位于 1 号染色体上，该基因突变导致植株变矮23。OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 具有体外催化 GA20-GA1、GA5-GA3、GA9-GA4、GA20-GA1和 GA44-GA38步骤的活性。间接证据还显示，OsGA3ox1蛋白可以催化GA9形成2,3-dehydro-GA9，GA20形成 GA5；OsGA3ox1 还具有 2 羟化酶的活性，可以催化 GA1形成 GA8、GA4形成 GA3421。较早的研究暗示 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 可能在水稻的不同组织中起作用，且具有不同的催化活性，但这两个基因在活性 GA 合成中如何分工协作至今未见系统报道9,21,24。本研究利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，敲除水稻 GA 合成关键基因 OsGA3ox1 和OsGA3ox2 获得突变体材料，观察突变体表型，分析OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 基因的表达模式，并对其不同部位的多种内源 GA 含量进行测定，系统研究了两个 GA 合成关键酶在水稻不同部位、不同发育阶段的催化活性，及水稻不同部位的主要活性 GA 形式和功能。1 材料与方法 1.1 实验材料 供试水稻材料为粳稻品种(Oryza sativa L.sub.japonica cv.Kitaake)，由作物不育资源创新与利用湖南省重点实验室提供。水稻 CRISPR/Cas9 基因编辑系统由北京大学瞿礼嘉教授惠赠。敲除突变体材料ga3ox1 和 ga3ox2 经基因编辑而成，以 Kitaake 作为野生型对照(wild type，WT)。水稻材料种植在湖南师范大学试验田，种植期间按照大田常规栽培管理。1.2 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 基因表达 利用 Trizol(美国 Invitrogen 公司)提取水稻幼苗期的根、地上部分，分蘖期的成熟叶、未伸长的叶，孕穗期茎和未开的花总 RNA，参照 cDNA 反转录试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)说明书，反转录获得 cDNA 第一条链，并进行半定量 RT-PCR 和实时荧光定量 PCR，以 OsActin2 作为内参基因。利用Primer 6.0 设计所需引物(表 1)。半定量 RT-PCR 扩增体系为 20 L，包含模板 1 L、上下游引物(10 mol/L)各 0.5 L、2PCR Mix 10 L 和 ddH2O 8 L。实时荧光定量 PCR 扩增体系和程序按照试剂盒(Go Taq qPCR Master Mix，美国 Promega 公司)说明书进行，实验在定量 PCR 仪(QuantStudio 5，美国 ABI 公司)中进行，每个样品设 3 个重复，每个实验重复 3 次。1.3 ga3ox1 和 ga3ox2 突变体植株的获得 利用 CRISPR/Cas9 基因编辑系统获得敲除突变体 ga3ox1 和 ga3ox2。分别在 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2的外显子区域各设计两个靶位点(表 1)，构建基因编辑 载 体 OsGA3ox1-Cas9-1、OsGA3ox1-Cas9-2 及OsGA3ox2-Cas9-1、OsGA3ox2-Cas9-2，重组载体构建参考 Miao 等25方法。将构建好的基因编辑载体转入农杆菌感受态 EHA105 中，应用农杆菌介导的遗传转化法转化水稻愈伤组织，通过抗性筛选、诱导分化获得水稻基因编辑植株。进一步对基因编辑植株的靶位点进行 PCR 扩增、测序，测序结果与基因组序列比对确定转基因植株靶位点的碱基变化情况。1.4 GUS 转基因植株的获得和组织化学显色 根据 NCBI 数据库，设计引物(表 1)克隆OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 基因 ATG 上游约 2 kb 的序列作为 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 的启动子。将扩增的序列重组到pCambia1301载体中，构建OsGA3ox1-GUS 和 OsGA3ox2-GUS 重组载体，并通过农杆菌介 848 Hereditas(Beijing)2023 第 45 卷 表 1 本研究所用引物信息 Table 1 Primers used in this study 引物名称 引物序列(53)用途 OsGA3ox1-RT-PCR F：CGAGACCGAGCGGAAGA 半定量 RT-PCR 和实时荧光定量 PCR R：GCCGACGACGACGATGA OsGA3ox2-RT-PCR F：TTCTCCAAGCTCATGTGGTC 半定量 RT-PCR 和实时荧光定量 PCR R：GCATCTCCTTGTGAAACTC OsActin2-RT-PCR F：ATGTGCCAGCTATGTATGTC 半定量 RT-PCR 和实时荧光定量 PCR R：CGTTCAGCAGTGGTAGTGA OsGA3ox1-Cas9-1 F：GCCGGAGTCGCACGTGTGGA 构建 CRISPR/Cas9 基因编辑载体 R：TCCACACGTGCGACTCCGGC OsGA3ox1-Cas9-2 F：CGATGAGAGCTCTGGGCGAG 构建 CRISPR/Cas9 基因编辑载体 R：CTCGCCCAGAGCTCTCATCG OsGA3ox2-Cas9-1 F：GCTCTGCTTCGACTTCCGGG 构建 CRISPR/Cas9 基因编辑载体 R：CCCGGAAGTCGAAGCAGAGC OsGA3ox2-Cas9-2 F：GAGAAGATGCGCGCCGTCCG 构建 CRISPR/Cas9 基因编辑载体 R：CGGACGGCGCGCATCTTCTC OsGA3ox1-GUS F：GGTTTTCATGCCATGCCAAT 构建 GUS 表达载体 R：GCATGAACTCGTTGGCTA OsGA3ox2-GUS F：ATAGTCCTCGGCAAGAAG 构建 GUS 表达载体 R：CGACGACGACGACGAT 导的遗传转化法获得分别由 OsGA3ox1和 OsGA3ox2的启动子驱动 GUS 表达的 ProOsGA3ox1:GUS 和ProOsGA3ox2:GUS 植株。将 GUS 转基因植株按常规方法种植，取幼苗时期的根和地上部分，分蘖期的成熟叶和未伸长的叶，孕穗期的穗和茎等组织进行GUS 显色分析26。1.5 内源 GA 含量测定 将 ga3ox1、ga3ox2 突变体和 WT 按照常规方式种植，分别在其幼苗期、分蘖期和孕穗期取根、未伸长的叶和发育中穗，液氮速冻，80保存备用。内源GA测定由武汉绿剑可瑞信科技有限公司完成。主要采用 UHPLC-MS/MS(Thermo Scientific Ultimate 3000 UHPLC coupled with TSQ Quantiva)测定，具体方法参考文献27。2 结果与分析 2.1 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 基因编辑突变体的鉴定 对 CRISPR/Cas9 编辑的阳性植株靶位点进行测序分析，获得 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 基因编辑的纯合突变体株系。OsGA3ox1 突变体命名为 ga3ox1-1和 ga3ox1-2，其中 ga3ox1-1 在第一个靶位点中增加了一个碱基“T”；ga3ox1-2 在第二个靶位点中缺失了一个碱基“C”(图 1A)。OsGA3ox2 突变体命名为ga3ox2-1 和 ga3ox2-2，其中 ga3ox2-1 在第一个靶位点中缺失了一个碱基“C”；ga3ox2-2 在第二个靶位点中缺失了一个碱基“C”(图 1B)。4 个突变体的碱基变化都使基因的 CDS 序列发生改变，导致突变株系中 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 蛋白翻译出现移码并提前终止(图 1C)。与野生型 OsGA3ox1 蛋白(384 个氨基酸)相比，ga3ox1-1 中 OsGA3ox1 基因突变导致翻译产生 44 个与野生型一致的氨基酸和 193 个异常氨基酸后终止；ga3ox1-2 中 OsGA3ox1 基因突变导致翻译产生 195 个与野生型一致的氨基酸和 31 个异常氨基酸后终止。与野生型 OsGA3ox2 蛋白(373 个氨基酸)相比，ga3ox2-1 中 OsGA3ox2 基因突变导致翻译产生 15 个与野生型一致的氨基酸和 145 个异常氨基酸后终止；ga3ox2-2 中 OsGA3ox2 基因突变导致翻译产生 103 个与野生型一致的氨基酸和 57 个异常氨基酸后终止。第9期 郝小花等:OsGA3ox 通过合成不同活性 GA 调控水稻育性及株高 849 图 1 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 基因编辑靶位点及突变体蛋白序列变化 Fig.1 The gene knockout sites of OsGA3ox1 and OsGA3ox2 and protein sequence changes in mutants A：OsGA3ox1 基因编辑靶位点及突变体靶位点序列变化；B：OsGA3ox2 基因编辑靶位点及突变体靶位点序列变化；C：OsGA3ox1和 OsGA3ox2 基因编辑突变体蛋白序列变化。图 C 中黑色线条代表与参考序列一致的氨基酸残基，红色线条代表与参考序列不一致的氨基酸残基；aa 表示氨基酸。2.2 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 基因突变对水稻生长发育的影响 将纯合的突变体 ga3ox1、ga3ox2 及 WT 水稻种植在相同的环境中，观察突变体不同时期的生长状态及与 WT 之间的差异。通过观察发现，突变体ga3ox1 在幼苗期的根长、株高与 WT 之间都没有显著差异(图 2，A 和 C)，孕穗期突变体 ga3ox1 的株高较 WT 略矮(图 2，B 和 C)，开花期可育花粉只有30%左右，而 WT 的花粉可育达到 90%以上(图 2，D和 J)，突变体 ga3ox1 的花粉可育率显著降低，导致其结实率降至 12.3%左右(图 2K)，说明 OsGA3ox1突变影响了花粉的育性。突变体 ga3ox2 的根长、花粉育性、结实率与 WT 之间都没有显著差异(图 2，D、E、J 和 K)，但无论是苗期还是开花期地上部分的高度都显著低于 WT(图 2，E 和 F)，开花期突变体的平均株高为 19.2 cm，仅为 WT 的 35%(图 2H)，突变体倒一节、倒二节和倒三节的平均长度分别为 4.2 cm、1.1 cm和 0.3 cm，分别为 WT 的 22.3%、12.0%和 8.6%(图 2，G 和 I)，说明 OsGA3ox2 缺失显著抑制了水稻地上部分的高度，且对各节位伸长的抑制程度不同。2.3 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 基因的组织表达特异性 为研究 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 的组织表达特性，取幼苗期的根、地上部分，分蘖期的成熟叶、未伸长的叶以及孕穗期的茎和未开的花为实验材料，提取总 RNA 然后逆转录为 cDNA，以 cDNA 为模板进行半定量 RT-PCR 及实时荧光定量 PCR，对OsGA3ox1和 OsGA3ox2的组织表达特异性进行分析。半定量 RT-PCR 分析发现，OsGA3ox1 在未开的花中具有较高的表达量，而 OsGA3ox2 在幼苗期的地上部分和未伸长的叶中具有较高的表达量(图 3A)。实时荧光定量 PCR 和半定量 RT-PCR 的结果基本一致(图 3，B 和 C)。850 Hereditas(Beijing)2023 第 45 卷 图 2 ga3ox1 和 ga3ox2 突变体表型 Fig.2 Phenotypes of ga3ox1 and ga3ox2 mutants A：WT 和 ga3ox1 突变体幼苗期植株形态；B：WT 和 ga3ox1 突变体孕穗期植株形态；C：WT 和 ga3ox1 突变体在幼苗期和孕穗期地下、地上长度统计；D：WT、ga3ox1 和 ga3ox2 突变体花粉碘液染色观察；E：WT 和 ga3ox2 突变体幼苗期形态；F：WT 和 ga3ox2突变体开花期形态；G：WT 和 ga3ox2 突变体开花期倒一、二、三节及节间形态(蓝色*表示 WT 倒一、二节的位置，红色*表示突变体倒一、二节的位置)；H：WT 和 ga3ox2 突变体成熟期株高统计；I：WT 和 ga3ox2 突变体成熟期倒一、二、三节节间长度统计(I、II、III 分别表示倒一、二、三节节间)；J：WT、ga3ox1 和 ga3ox2 突变体花粉育性统计；K：WT、ga3ox1 和 ga3ox2 突变体结实率统计。A、G 图比例尺=2 cm，B、F 图比例尺=10 cm，D 图比例尺=40 m，E 图比例尺=3 cm；显著性分析以 WT 为对照，*表示 P0.01，极显著性差异。图 3 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 基因在不同组织中的表达模式 Fig.3 Expression patterns of OsGA3ox1 and OsGA3ox2 in different tissues A：不同部位中 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 基因表达半定量 RT-PCR 分析；B、C：OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 基因表达实时荧光定量 PCR分析；DF：OsGA3ox1-GUS 植株主要显色部位；G：OsGA3ox2-GUS 植株主要显色部位(从左至右分别为：展开新叶、未展开新叶、叶鞘)。D、G 图比例尺=1 cm，E 图比例尺=0.5 mm，F 图比例尺=40 m。第9期 郝小花等:OsGA3ox 通过合成不同活性 GA 调控水稻育性及株高 851 同时，用 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 的启动子序列构建 ProOsGA3ox1:GUS、ProOsGA3ox2:GUS 载体，并用农杆菌介导的遗传转化获得转基因植株。通过PCR 鉴定获得阳性植株，对不同株系的阳性植株进行 GUS 染色。OsGA3ox1 的 GUS 植株显色部位主要在穗部，且不同发育时期的穗均有显色(图 3D)；进一步观察发现，穗部的花药和花粉粒中显色较深(图3，E 和 F)。OsGA3ox2 的 GUS 植株染色主要在未伸长的叶中着色最深(图 3G)。OsGA3ox1 和 OsGA3ox2的 GUS 植株染色结果与半定量 RT-PCR 和实时荧光定量 PCR 结果基本一致，表明 OsGA3ox1 主要在穗部花药及花粉粒中表达，OsGA3ox2 主要在未伸长的叶中表达。2.4 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 突变对未开的花中 GA 含量的影响 将 WT、ga3ox1 和 ga3ox2 突变体种植于相同的环境中，在孕穗期取未开的花进行内源 GA 检测。结果发现，在 GA 合成的通路上主要内源 GA 的含量在突变体 ga3ox1、ga3ox2 和 WT 之间均存在差异(图 4)。检测到的优势活性 GA 种类为 GA4和 GA7，但突变体ga3ox1花中未检测到GA7，表明OsGA3ox1具有催化 GA9形成 GA7的活性。GA3ox1 突变使 GA7合成受阻，ga3ox1 突变体花粉育性的改变与 GA7的含量密切相关。同时，与 WT 相比，ga3ox1、ga3ox2突变体花中 GA1、GA3、GA4和其他多种内源 GA 含量也均有显著降低，表明 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2在穗中协同参与或影响这些 GA 的合成。另外，在ga3ox1 突变体花中未检测到 GA8，暗示 OsGA3ox1可能还具有催化 GA1形成 GA8的活性。2.5 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 突变对未伸长的新叶中 GA 含量的影响 将 WT、ga3ox1 和 ga3ox2 突变体种植于相同的环境中，在分蘖期取未伸长的新叶进行内源 GAs 的 图 4 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 突变对花中 GA 含量的影响 Fig.4 Effects of OsGA3ox1 and OsGA3ox2 mutations on the content of GA in flowers n.d.表示未检出；浅灰色背景表示活性 GAs；显著性差异分析以 WT 为对照，*表示 P0.01，极显著性差异。852 Hereditas(Beijing)2023 第 45 卷 检测。结果表明，在 GA 合成的通路上主要内源 GA的含量在 ga3ox1、ga3ox2 突变体和 WT 之间存在差异(图 5)。在 WT 和 ga3ox1 突变体未伸长的新叶中检测到 GA1，而在 ga3ox2 突变体中未检测到 GA1，表明 OsGA3ox2 具有催化 GA20形成 GA1的活性，OsGA3ox2 突变使 GA1合成受阻，ga3ox2 突变体株高的改变与 GA1的含量密切相关。两种突变体ga3ox1、ga3ox2 和 WT 叶中都检测到少量 GA3，但没有显著差异。在 3 种材料的叶中均未检测到 GA4和 GA7，说明 ga3ox2 突变体株高矮化主要与 GA1有关，而与另外 3 种活性 GAs(GA3、GA4和 GA7)关系不大，GA3ox2 突变使茎叶中 GA1合成受阻，从而导致株高严重矮化。同时，OsGA3ox1 和 OsGA3ox2在茎叶中可以协同催化少量 GA3的合成。2.6 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 突变对根中 GA含量的影响 将 WT、ga3ox1 和 ga3ox2 突变体种植于相同的环境中，在幼苗的生长旺盛期取其根部进行内源 GA的检测。在 GA 合成途径中，由 GA12形成 GA4/7的合成途径中大部分 GA 都未检测到；由 GA53形成GA1/3合成途径中仅检测到部分 GA，但未检测到大量存在的活性形式 GA，仅在 WT 和 ga3ox2 突变体中检测到少量 GA3，且 GA3的含量差异不显著；而在 ga3ox1 突变体中未检测到 GA3、GA5和 GA20，但检 测 到 GA20的 前 体 物 质 GA19，说 明 在 根 中OsGA3ox1 可能具有催化 GA19形成 GA20的活性，最终合成微量 GA3(图 6)。图 5 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 突变对叶中 GA 含量的影响 Fig.5 Effects of OsGA3ox1 and OsGA3ox2 mutations on the content of GA in elongating leaves n.d.表示未检出；浅灰色背景表示活性 GAs；显著性差异分析以 WT 为对照，*表示 P0.01，极显著性差异。第9期 郝小花等:OsGA3ox 通过合成不同活性 GA 调控水稻育性及株高 853 图 6 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2 突变对根中 GA 含量的影响 Fig.6 Effects of OsGA3ox1 and OsGA3ox2 mutations on the content of GA in root n.d.表示未检出；浅灰色背景表示活性 GAs；显著性差异分析以 WT 为对照，*表示 P0.01，极显著性差异。3 讨论 GA 在水稻生殖发育中起调控作用，活性 GA 不足会导致花粉败育。早期研究发现花药中存在大量的 GA4/7混合物。Honda 等12对水稻不育系，尤其是温敏雄性不育系(Norin PL12)不育和可育条件下花 药中的内源活性 GA 水平进行检测，发现随着不育性的增加，花药中 GA4/7水平显著降低，表明 GA4/7与花粉的发育密切相关。但由于当时的检测技术所限，该研究仅检测到 GA4/7混合物。本研究通过检测WT、ga3ox1、ga3ox2 突变体未开的花、未伸长的新叶和根组织中的活性 GA 水平，发现 WT 未开的花中存在大量的 GA4和 GA7，GA4在两个突变体中含量均大幅下降，GA7在 ga3ox2 突变体的花中含量约为 WT 的一半，但在花粉育性缺陷的 ga3ox1 突变体中未被检出(图 4)。因此，本研究推测在未开的花中OsGA3ox1 具有特异的催化合成 GA7的活性，且 GA7水平与花粉育性密切相关。很多与花药发育尤其是 绒毡层发育相关基因的突变影响花粉粒的发育，绒毡层细胞为花粉粒的发育提供营养和激素等。多种激素参与花粉育性调控，GA 信号参与调控水稻花粉育性的分子机制也在逐步被揭示，如 GA 信号可以通过调控 OsMS188 的表达调控水稻雄性育性2。GA信号还可以通过转录因子OsUDT1/OsTDR促进绒毡层发育相关基因的表达，正调控水稻的雄性育性5，但 GA7是否识别特异的 GA 受体，并通过特异的DELLA 蛋白，传递花粉发育信号，还有待进一步分析。另外，在 WT 未开的花中还有大量 GA4和少量GA1、GA3积累，两个突变体中也有这 3 种活性 GA，但其含量都呈现显著下降，表明 OsGA3ox1 和OsGA3ox2 都参与了未开的花中 GA1、GA3和 GA4的合成，但这些活性 GA 是否也参与花粉育性调控尚 854 Hereditas(Beijing)2023 第 45 卷 不明确，其在花器官发育中的作用值得进一步研究。水稻株高受多种激素包括 GA 的调控。研究表明，活性形式的 GA1主要调节株高，但并没有确切证据表明水稻未伸长的叶中 GA1是由 OsGA3ox2 催化合成，体外活性分析表明 OsGA3ox1 和 OsGA3ox2都能催化合成 GA121。本研究通过对 WT、ga3ox1和 ga3ox2 突变体未伸长的叶中活性 GA 的测定，发现 GA1在 ga3ox1 突变体中的水平跟 WT中基本一致，但在突变体 ga3ox2 中未检出，表明 OsGA3ox2 在未伸长的叶中负责 GA1的催化合成，调控株高。GA能通过促进细胞周期蛋白、木葡聚糖内糖基水解酶(OsXET/OsXTH)28或细胞壁延展蛋白基因(OsEXP5、OsEXP6、OsEXP11)29,30的表达调节水稻茎秆长度。本课题组前期对矮杆突变体ga3ox2的茎秆进行细胞学观察，发现茎秆纵向细胞数目减少、长度变短，细胞周期和细胞伸长的相关基因(OsCDKB2;1、OsE2Fl、OsMCM3、OsEXPA16 和 OsXTH28)的表达量在突变体中显著降低31。目前，GA 信号调控水稻株高的分子调控机制研究也取得了新进展。GA 信号通路关键蛋白 OsSLR1 能够与 OsIDD2 一起结合到 miR396 基因启动子部位，调控 miR396 的表达，miR396 通过降解 OsGRF 的 mRNA 抑制 OsGRF 的活性，从而影响下游的细胞周期等基因的表达来调控株高32。Kuroha 等33对深水稻等资源的研究，发现了 GA4在株高调控中起作用，正常条件下，GA1在水稻茎秆伸长中起作用，在淹水环境下，水稻启动乙烯信号，激活乙烯响应转录因子 OsEIL1a 结合到 SD1 启动子部位，激活 GA4在茎秆大量合成调控茎秆生长，GA4对淹水条件下茎秆快速伸长起决定性的作用。20 世纪 60 年代，由 SD1 基因掀起的绿色革命，使得小麦、水稻等农作物矮化，显著提高了粮食产量，为解决世界粮食问题做出了重大贡献。目前，有更多的矮杆、半矮杆基因/等位基因被挖掘，在农作物遗传育种中显示了潜在的应用价值34,35。对OsGA3ox1和 OsGA3ox2在不同组织中的表达模式和对 GA 催化活性的研究，为阐明 OsGA3ox1 和OsGA3ox2 在 GA 生物合成通路中的作用，深入理解OsGA3ox 的功能提供了基础。为进一步利用基因编辑技术(CRISPR/Cas9)定向培育植物矮化品种，加快水稻矮化种质资源育种进程提供了参考。参考文献(References)：1 Gao SP,Chu CC.Gibberellin metabolism and signaling:targets for improving agronomic performance of crops.Plant Cell Physiol,2020,61(11):19021911.2 Jin Y,Song XY,Chang HZ,Zhao YY,Cao CH,Qiu XB,Zhu J,Wang ET,Yang ZN,Yu N.The GA-DELLA-OsMS188 module controls male reproductive develop-ment in rice