烟草TCP基因家族的鉴定及表达分析_张路阳.pdf

研究报告生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(6):248-258收稿日期：2022-09-16基金项目：中国烟草总公司河南省公司重点项目（2021410000240021），中国烟草总公司浙江工业有限公司（ZJZY2021B009），福建烟草总公司南平市公司（2021350700240072，NYK2022-04-03），贵州烟草总公司贵阳公司（2020-07），湖南烟草总公司长沙市公司（21-23A04），贵州烟草总公司铜仁市公司（202101）作者简介：张路阳，男，硕士研究生，研究方向：烟草育种；E-mail:通讯作者：张智强，男，博士，讲师，研究方向：烟草育种；E-mail:xiao_烟草 TCP 基因家族的鉴定及表达分析张路阳1 韩文龙1 徐晓雯2 姚健2 李芳芳3 田效园3 张智强1（1.河南农业大学烟草学院，郑州 450002；2.河南省烟草公司许昌市公司，许昌 461000；3.中国烟草总公司河南省公司，郑州 450002）摘 要：TCP 基因是植物特有的转录因子，对植物的生长发育起到重要的作用。鉴定烟草 TCP 基因家族，为烟草 TCP 基因功能研究及遗传改良提供理论依据。基于烟草全基因组数据，通过 BLAST 对烟草 TCP 基因家族进行鉴定，利用生物信息学的方法分析了该家族成员的理化性质、基因结构、蛋白质结构域、染色体分布、系统进化及启动子分析，并利用 RT-qPCR 验证了 TCP 基因家族在烤烟不同品种各个组织的表达情况。烟草中共鉴定了 20 个 TCP 基因，将其分为两大类 Class I 与 Class II；已知的 TCP 基因位于不同的染色体上且分布不均匀，所有 TCP 基因均具有保守的结构域；TCP 基因家族启动子区域显著富集生长发育和激素响应的顺式元件，部分 TCP 基因还具有低温胁迫的作用元件；20 个 NtTCPs 基因在 K326 和 Ti706 不同组织和不同时期叶片内存在不同程度的表达，NtTCPs 基因在烟草 K326 和 Ti706 中的表达具有组织特异性。其中 Class I 亚族基因在 6 个组织和苗期叶片内表达水平较高，而 Class II 亚族基因在幼苗叶片、上部叶和中部叶表达水平较高。研究结果揭示了烟草 TCP 基因家族成员在烟草生长发育过程中起到重要作用，为探究烟草 TCP 基因家族的生物学功能提供了基础。关键词：烟草；TCP 基因；全基因组鉴定；生物信息学；组织差异；表达模式分析；荧光定量 PCRDOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2022-1141Identification and Expression Analysis of the Tobacco TCP Gene FamilyZHANG Lu-yang1 HAN Wen-long1 XU Xiao-wen2 YAO Jian2 LI Fang-fang3 TIAN Xiao-yuan3 ZHANG Zhi-qiang1（1.Tobacco College,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002;2.Xuchang Tobacco Company of Henan Province,Xuchang 461000;3.Henan Province Tobacco Company,Zhengzhou 450002）Abstract:TCP gene is a plant-specific transcription factor,and plays an important role in plant growth and development.The identification of tobacco TCP gene family may provide theoretical basis for the study of tobacco TCP gene function and genetic improvement.Based on the whole genome data of tobacco（Nicotiana tabacum L.）,the tobacco TCP gene family was identified by BLAST,and the physicochemical properties,gene structure,protein domain,chromosome distribution,phylogeny evolution and promoter analysis of the family members were analyzed by bioinformatics.The expressions of TCP gene family in various tissues of different flue-cured tobacco varieties were verified via RT-qPCR.A total of 20 TCP genes were identified in tobacco,and they were divided into two categories,Class I and Class II.The known TCP genes were located on different chromosomes and were unevenly distributed,and all TCP genes had conserved domains.The cis-elements of growth,development and hormone response were significantly enriched in the promoter regions of the TCP gene family,and some TCP genes also had low-temperature stress elements;20 NtTCP genes were expressed to different degrees in different tissues and leaves of K326 and Ti706,and NtTCP genes were expressed in tobacco K326 and Ti706,and the expressions were tissue-specific.The expressions of subfamily 2023,39(6)249张路阳等：烟草 TCP 基因家族的鉴定及表达分析烟草（Nicotiana tabacum L.）是我国重要的经济作物，在烟草生产中，由于顶端优势的存在，烟草体内大部分营养物质优先向顶端输送，严重影响烟草的产量和质量。为了提升烟草叶片的质量，去除顶端花序（打顶）是一项重要的栽培措施1。目前 TCP 转录因子在植物生长发育中具有重要的调控作用。TCP（Teosinte branched1/Cincinnata/Proliferating-cell factor）基因家族是植物特有的一类转录因子。其命名由玉米（Zea mays L.）中的 TB1（Teosinte Branch 1）基 因、金 鱼 草（Antirrhinum majus）中的 CyC（Cycloidea）基因，以及水稻（Oryza sativa）中的 PCF1 和 PCF2（PROLIFERATING CELL FACTORS 1 and 2）基因的首字母组成2-4。根据氨基酸序列的差异，TCP 基因家族可以分为 Class I 和Class II 两个亚族：Class I 亚族以 PCF 家族基因为主；Class II 亚族成员之间差异很大，又细分为 CIN和 CYC/TB1 两个亚族。Class II 亚族相比较 Class I亚族在结构上缺 4 个氨基酸序列5。目前多种植物已经完成基因测序，越来越多的 TCP 基因家族被鉴定。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）6、水稻7、番茄（Solanum lycopersicum L.）8、茄子（Solanum melongena L.）9、马铃薯（Solanum tuberosum L.）10、香蕉（Musa nana Lour）11等植物中 TCP 基因的研究已有广泛报道。已有研究表明，TCP 基因在植物种子萌发、侧枝的形成，叶片、花、果实及配子体的发育和响应逆境胁迫中具有重要的调控作用，广泛参与植物生长发育的各个阶段，而且影响水杨酸、乙烯、脱落酸和生长素等的生物合成12。拟南芥中AtTCP1 参与花的分生组织发育13，AtTCP4 调控胚的发育和侧枝生成14，AtTCP14 和 AtTCP15 调节赤霉素信号通路影响种子萌发过程中胚芽的生长15，AtTCP20 参 与 茉 莉 酸（JA）代 谢16，AtTCP21、AtTCP22 和 AtTCP23 调控植株的生长17。TCP 基因家族 Class II 亚族基因成员在调控植物叶片发育方面发挥着十分重要的作用。拟南芥中，AtTCP1 是CYC 的同源物，通过调节油菜素甾体生物合成基因 DWARF4 的表达水平调控拟南芥的生长发育13。CIN 基因控制叶片细胞的增殖分化，影响叶片的形态，拟南芥 TCP2、TCP3 等基因受到 miR319 的调控，在叶片形态建成过程中发挥巨大作用18。同时，番 茄 TCP2、TCP11、TCP14、TCP15、TCP19、TCP24 基因在番茄叶形发育中也起到关键作用19。TCP 基因除了影响植物生长发育外，还在逆境胁迫中起到重要的作用。拟南芥中，AtTCP15 蛋白通过与 MOC1 蛋白互作，调控免疫受体基因 SNC1 的表达，参与植物免疫应答，还能与 ZRK（核激酶）互作，调控植物温敏性免疫20。马铃薯 TCP 基因在盐和甘露醇的胁迫下表达下调10，OSTCP21 是水稻防御稻瘟病的正调控因子21，拟南芥 TCP5 和 TCP17可以通过调节光敏色素作用因子的表达来抵抗高温胁迫22。TCP 基因家族还参与了昼夜节律，拟南芥中的 AtTCP2、AtTCP3、AtTCP11、AtTCP15 和AtTCP21 等多个基因也被证实可与生物钟信号通路中的不同调控蛋白产生互作。其中 AtTCP21 基因通过影响 CCA1 基因的表达（CCA1 蛋白能与 AtTCP1的启动子区域结合），从而影响植物生物钟调控环路的负反馈调节23。上述研究结果表明，TCP 基因家族参与了植物的生长发育过程和叶片形成过程。目前烟草TCP基因家族及其成员表达尚未报道，本研究利用生物信息学的方法，以拟南芥 TCP 家族蛋白质序列为比对条件，对烟草基因组数据库进行检索，筛选并鉴定 20 个 TCP 基因家族成员，并对其家族成员的理化性质、基因结构、系统进化、启动子进行分析，以及通过 RT-qPCR 的技术研究基因在不同品种、不同组织和不同时期叶片的表达情况。通过分析 TCP 基因家族在烟草中的表达，为全面了解 TCP 基因家族在烟草整个生长发育过程中的生物Class I genes were higher in 6 tissues and leaves at seedling stage,while the expressions of subfamily Class II genes were higher in seedling leaves,upper leaves and middle leaves.The results revealed that the members of tobacco TCP gene family play an important role in the growth and development of tobacco,which provides a basis for exploring the biological functions of tobacco TCP gene family.Keywords:tobacco;TCP gene;genome-wide identification;bioinformatics;organizational differences;expression pattern analysis;RT-qPCR生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.6250学功能提供新的信息，筛选有利于提高叶片质量的基因。1 材料与方法1.1 材料试验材料为普通烟草 K326 和 Ti706，由河南农业大学烟草学院育种实验室提供。1.2 方法1.2.1 烟草 TCP 基因家族成员鉴定及序列特征分析 从拟南芥（www.arabidopsis.org）数据库中下载拟南芥所有的 TCP 蛋白序列，在茄科基因组数据库（https:/ 值100），获得普通烟草 NtTCP 蛋白的氨基酸序列。在线网站上分析（https:/web.expasy.org/protparam/）烟草 TCP 蛋白的氨基酸数目、等电点（pI）、相对分子量大小、亲水性等理化性质。亚细胞定位分析则是利用在线软件 Soft Berry（http:/ 烟草 TCP 基因家族的进化关系分析 将烟草TCP 基因家族蛋白序列与模式植物拟南芥的 TCP 基因家族蛋白序列，利用 MEGA11 软件进行 Clustal W比对，使用邻接法（neighbor-joining method,NJ），设置参数自展值（bootstrap replications）为 1 000，利用 J-T-T（Jones-Taylor-Thornton）模型构建。蛋白质序列比对使用 DNAMAN 软件，使用默认参数。1.2.3 烟草 TCP 基因结构、保守基序及结构域分 析 通 过 MEME 在 线 网 站（http:/meme-suite.org/tools/meme）对烟草 TCP 蛋白序列进行 motif 分析，CBLs 设置 Motif 数量为 10，其他设置使用默认参数。保守结构域（domain）分析采用 NCBI 中 CDD（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）；利用 Tbtools 中 Gene Structure View 进行 Motif和保守结构域的可视化。1.2.4 烟草 TCP 基因家族染色体定位 从烟草基因组的数据中获得 TCP 基因在染色体上的位置信息，利用 Tbtools24（v1.082）软件构建可视化染色体定位图。1.2.5 烟草 TCP 基因家族顺式作用元件分析 通过软件 Tbtools 对烟草 TCP 家族基因起始密码子上游 1 500 bp 的启动子区序列进行提取，然后通过PlantCare 数 据 库（http:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）对烟草 TCP 家族基因启动子区序列进行顺式作用元件分析，最后利用 TBtools 对结果可视化。1.2.6 表达模式分析 利用植物总 RNA 提取试剂盒，分别提取根、茎、叶、花瓣、幼蕾、萼片，成熟期不同部位叶片的 RNA。然后进行反转录，取RNA 溶液 9 L，dT（18）primer 4 L，在 70反应10 min；然后加入 5 buffer 4 L，dNTP（10 nm）2 L，反转录酶 0.5 L，Rnase Inhibitor 0.5 L，在40反应 2 h，70反应 15 min，在-20保存。检测 cDNA 的质量，确认反转录成功后，再进行荧光实时定量 PCR。根据烟草 NtTCP 的 CDS 设计引物，将引物序列交给北京擎科生物科技有限公司进行合成（表 1）。荧光实时定量 PCR 采用诺唯赞生物公司的 Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix，采 用 的 20 L 体 系：2 Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 10 L，模板 0.4 L，水 8.8 L，引物0.8 L。荧光实时定量PCR程序：95预变性30 s；95 10 s，60 30 s，40 个循环。95 15 s，60 60 s，95 15 s 生成溶解曲线。采用 2-CT法对基因相对表达量进行计算25。2 结果2.1 烟草TCP基因家族鉴定及基本特征分析本研究以拟南芥 TCP 核苷酸序列为检索序列，基于烟草全基因组数据库，共鉴定出 20 个烟草 TCP基因（表 2）。根据烟草 TCP 基因家族成员的蛋白质理化性质分析结果显示，烟草 TCP 基因家族编码的氨基酸长度为 161-589 个，分子量为 16.833-66.702 kD，等电点为 5.43-9.82。所有烟草 TCP 蛋白的GRAVY 值为负，表明它们都是亲水性的蛋白。亚细胞定位预测发现，烟草 TCP 基因都定位于细胞核中。2.2 烟草TCP基因家族成员的系统进化树分析为了进一步分析烟草 TCP 基因家族的系统进化关系，本研究利用 MEGA 软件对模式植物拟南芥与烟草的 TCP 基因进行系统进化分析。结果（图 1）显 示，20 个烟草 TCP 蛋白和 24 个拟南芥蛋白在系统进化树中呈现了明显的聚类现象。基因聚类分析结果显示，TCP 基因家族可分为两个亚族：Class 2023,39(6)251张路阳等：烟草 TCP 基因家族的鉴定及表达分析表 1 烟草 TCP 基因家族表达分析的实时荧光定量引物Table 1 Real-time PCR primers for tobacco TCP gene expression analysis基因 Gene上游引物 Forward primer（5-3）下游引物 Reverse primer（5-3）NtTCP1TGTCGACGTCGGTAGAAGCTACGTCCATCGACTTTGCTATGANtTCP2CAGCCACTCCCTATGTCATCACATGGCCATTAGTTCCCAAATNtTCP3TATGCAGTTCCAGAGCTTCCATTTGGTGGTGCAGCAAAATAGNtTCP4ATAGCAGCCACTGGAACTGGTTTGAAACAAACCTCGTCGTTGNtTCP5TGGGTCACAAGTCTGAAGGTGGGGATTGTACCTGTTCCCGTANtTCP6AACCTTCTAAAGACCGCCACATTGTGACCCAATTCTCTGGTGNtTCP7ACGCGAATTGGGTCATAAATCGGAATTGTTCCATTGCCTGTTNtTCP8GGGCAGTGGGCTCTAGTAATGCCACAACTGAGGTGGATACGANtTCP9CCATTGCATTTCATGCCTAGAGACATTCCCAACCCAAGATGTNtTCP10TGACGGTAGAGGAAGGCGTATTTTGGCCATCAGACTTGTGACNtTCP11ATAGCAGCCACTGGAACTGGTTGGGAGAGCGAAAAATTAGGANtTCP12GCAATGATAATGCTGGGGAATGCATTTGCATTGTCACCACTTNtTCP13TTTACCCCACTTGGGTTTGACAACAAGTACCCACCACCTTGGNtTCP14TGTCGACGTCGGTAGAAGCTACCATTATTGCCAGCATCAGAANtTCP15ATTTGCGAGGAGGCACTATGTTCAACTTTCGTGTGCCTGTCTNtTCP16TTGCTTCATCACCAAAACCAGGACCGAGTTCTACTGGCTGCTNtTCP17GTTGAAGGCAGAGGAAGGAGATGTTGCAGCAATTATGGAAGGNtTCP18CCTCCGAAGAAACAAACCAAGGTTTCTCCGTCGGACTTATGGNtTCP19TCTGGATGTTACCGGTGAGTGACCATTGAACCCAACTGAACCNtTCP20TGACGGTAGAGGAAGGCGTATTTTGACCATCGGACTTGTGAC表 2 烟草 TCP 家族的基本信息Table 2 Basic information of TCP gene family members in tobacco基因名称Gene name基因组登录号Gene ID氨基酸数Number of amino acids分子量Molecular weight/kD等电点pI亲水性GRAVY亚细胞定位Subcellular localizationNtTCP1Nitab4.5_0000069g0220.124725.8957.93-0.442细胞核 NucleusNtTCP2Nitab4.5_0000206g0010.144248.5028.55-0.907细胞核 NucleusNtTCP3Nitab4.5_0000246g0120.132335.4135.51-0.822细胞核 NucleusNtTCP4Nitab4.5_0000269g0060.136739.8547.37-0.715细胞核 NucleusNtTCP5Nitab4.5_0000303g0270.132634.9606.87-0.784细胞核 NucleusNtTCP6Nitab4.5_0000365g0240.141244.2908.99-0.746细胞核 NucleusNtTCP7Nitab4.5_0000519g0050.122224.0049.82-0.486细胞核 NucleusNtTCP8Nitab4.5_0000832g0020.135738.0075.53-0.448细胞核 NucleusNtTCP9Nitab4.5_0000948g0150.155659.6937.19-0.758细胞核 NucleusNtTCP10Nitab4.5_0001089g0050.116116.8337.33-0.244细胞核 NucleusNtTCP11Nitab4.5_0001188g0020.139943.8386.89-0.823细胞核 NucleusNtTCP12Nitab4.5_0003077g0060.1 59666.7016.14-0.808细胞核 NucleusNtTCP13Nitab4.5_0003202g0050.142046.3576.57-0.793细胞核 NucleusNtTCP14Nitab4.5_0004301g0070.130031.5478.65-0.324细胞核 NucleusNtTCP15Nitab4.5_0005379g0040.135938.2065.43-0.444细胞核 NucleusNtTCP16Nitab4.5_0005709g0020.1 58965.9946.65-0.817细胞核 NucleusNtTCP17Nitab4.5_0007375g0060.129532.0987.14-0.744细胞核 NucleusNtTCP18Nitab4.5_0007913g0020.154458.3327.00-0.761细胞核 NucleusNtTCP19Nitab4.5_0009198g0010.1 41944.8408.04-0.804细胞核 NucleusNtTCP20Nitab4.5_0011777g0010.126127.5399.71-0.432细胞核 Nucleus生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.6252I 亚族和 Class II 亚族；Class II 亚族又被分为 CIN和 CYC/TB1 两个亚族。在 20 个烟草 TCP 蛋白中，Class I 亚族含有的 TCP 基因数目最多，有 15 个，Class II 亚族含有 5 个 TCP 基因。图 1 烟草与拟南芥 TCP 基因家族系统进化分析Fig.1 Phylogenetic tree of TCPs in tobacco and Arabidopsis2.3 烟草TCP基因家族结构分析本研究对 NtTCP 进行了基因结构分析，结果（图2）显示，烟草的 20 个 TCP 基因家族成员结构比较简单，全部具有编码区域（CDS），不具有非翻译区（UTR），其中 8 个基因具有内含子。同时，为了更好地了解烟草 TCP 蛋白序列的结构（Motif）特征，鉴定了 10 个不同的保守基序。结果（图 3）表明，20 个烟草 TCP 蛋白都含有保守基序，Motif 2、Motif 3 和 Motif 10 是 Class I 亚族含有的保守基序。Motif 5、Motif 7 和 Motif 9 是 Class II 亚族特有的保守基序。Motif 1 和 Motif 6 是每个 TCP 家族成员都共有的保守基序。同一亚族的成员具有相似的基序组成，因此亲缘关系较近的基因含有 Motif 的种类和分布相似。2.4 烟草TCP基因家族染色体定位对烟草 TCP 基因家族分离鉴定后，绘制了 20个 TCP 基因家族成员在染色体的位置。分析结果（图 4）显示，烟草 12 个 TCP 基因不均匀地分布在10 条染色体上，其中在染色体 Nt17 上含有 3 个 TCP基因，其余染色体上只定位了一个基因。还有 8 个TCP 基因未定位在染色体上。2.5 烟草TCP家族基因启动子区的顺式作用元件分析顺式作用元件（cis-acting element）对于基因的转录调控具有十分重要的功能。为进一步了解烟草 TCP 启动子区域顺式作用元件特征，提取 TCP起始密码子上游 1 500 bp 序列上传到 PlantCARE网站查找各类顺式作用元件。研究发现，14 个烟草 TCP 存在光信号响应顺式作用元件，推测其功能与光响应通路有关。还鉴定到 5 种激素响应元件，其中 10 个烟草 TCP 转录因子含有 gibberellin-图 2 烟草 TCP 基因家族结构与进化Fig.2 Gene structure and evolution of TCP gene family in tobacco图 3 烟草 TCP 基因家族保守基序Fig.3 Conserved motifs of TCP gene family in tobacco2023,39(6)253张路阳等：烟草 TCP 基因家族的鉴定及表达分析responsive element 元件，这部分家族成员会响应赤霉素的应答反应；7 个烟草 TCP 转录因子含有salicylic acid responsiveness 元件，这部分基因家族成员会响应水杨酸的应答反应；11 个烟草 TCP 转录因子含有 MeJA-responsiveness 元件，这些基因家族成员会响应茉莉酸的应答反应；烟草 TCP 转录因子含有 abscisic acid responsiveness 元件，这些基因家族成员会响应脱落酸的应答反应；4 个烟草 TCP 基因含有 auxin-responsive 元件，这些基因家族成员会响应生长素应答反应。其次，还有生长发育和逆境胁迫相关顺式作用元件，主要包括胚乳特异性表达（endosperm-specific negative expression）、分 生 组 织表达（meristem expression）、防御应激响应（defense and stress responsiveness）和低温响应（low-temperature responsiveness）（图 5）。综上，TCP 可能参与烟草生长发育调控及多种胁迫调控途径。图 4 烟草 TCP 基因家族染色体定位Fig.4 Chromosomal locations of TCP gene family in tobacco图 5 烟草 TCP 基因家族启动子区域顺式元件Fig.5 Cis-acting elements in the promoter region of TCP gene family in tobacco生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.62542.6 烟草TCP基因家族成员的表达分析2.6.1 烟草 TCP 基因在不同部位的表达分析 基因的表达模式对于理解基因的功能具有十分重要的参考意义。为了分析 NtTCP 基因在不同组织或器官中的表达情况，本研究利用 RT-qPCR 技术分析了 20个 NtTCP 基因在不同品种烟草幼苗期根、茎、叶和大田成熟期的叶花、蕾、萼片中的表达情况。结果（图 6）显示，在 K326 中不同的 NtTCP 基因的表达差异较大，其中 NtTCP18 基因在根中表达较高，NtTCP1/2/5/8/9/10/14/18/19/20 在茎中具有较高的表达量，NtTCP8/13/14 在叶中具有较高的表达量，NtTCP1 在花中具有较高的表达量，NtTCP1/10/14 在萼片中具有较高的表达量，NtTCP1 和 NtTCP9 在蕾中具有较高的表达量。在 Ti706 中，NtTCP1/2/5/18在根中具有较高的基因表达量，NtTCP5/18/19/20 在茎中具有较高的表达量，NtTCP5/13/14 在叶片中具有较高的基因表达量，NtTCP5/13/14 在花中具有较高的基因表达量，NtTCP2/9/13/14/20 在萼片中具有较高的基因表达量，NtTCP1/2/3/4/5/10/14/18/19/20在蕾中具有较高的基因表达量。不同 TCP 基因在K326 和 Ti706 中的表达量具有较大的差异，其中NtTCP7基因只在K326叶和花中表达，而在Ti706根、花和蕾中表达；NtTCP17 基因在 K326 根中不表达，而在 Ti706 茎中不表达。2.6.2 烟草 TCP 基因在不同发育时期的表达分析 为了研究烟草 TCP 基因家族在不同品种烟草叶片不同时期的表达模式，通过 RT-qPCR 技术分析了 TCP 基因家族在 K326 和 Ti706 幼苗、5 d 苗期、7 d 苗期、成熟期烟草上部叶、中部叶、下部叶的表达情况。结果（图 7）显示，NtTCP 基因 在 K326 和 Ti706 不 同 时 期 的 叶 片 的 表 达 是有 差 异 的。在 K326 中，NtTCP8/13/14 在 幼 苗叶 片 表 达 量 较 高，NtTCP1/3/4 在 5 d 苗 期 表 达量 较 高，NtTCP1/3/5/9/10/12/14/19 在 7 d 苗 期表 达 量 较 高，NtTCP2/3/10/12 在 上 部 叶 表 达 量较 高，NtTCP1/2/3/13/18 在 中 部 叶 表 达 量 较 高，NtTCP1/2/13/18/20 在下部叶表达量较高。在 Ti706中，NtTCP5 在幼苗叶片中表达量较高，NtTCP19在 5 d 苗期表达量较高，NtTCP1/18/20 在 7 d 苗期表达量较高，NtTCP2/3/13/14 在上部叶表达量较高，NtTCP1/2/3/13/14/18/20 在中部叶表达量较高，NtTCP1/2/13/18 在下部叶表达量较高。不同 TCP基因在 K326 和 Ti706 不同时期叶片中具有差异，NtTCP7 基因在 Ti706 中表达，而不在 K326 中表达；NtTCP17 在 Ti706 不同时期叶片中都表达，而只在K326 幼苗叶片时期表达。3 讨论3.1 烟草TCP家族基因的结构特征及功能TCP 基因家族是高等植物特有的转录因子，影响植物的生长发育。随着生物信息学的发展，越来越多的物种完成了 TCP 基因家族成员的鉴定和分析。目前研究表明水稻 TCP 基因家族基因被鉴定出27 个，马铃薯10中 27 个，拟南芥6中 23 个，番 茄8,26中 36 个，茄子9中 29 个。本研究对烟草TCP 基因家族成员进行了鉴定和分析，共鉴定了 20个烟草 TCP 基因，低于其他物种中 TCP 基因数量，可能与不同物种之间基因扩张程度有关。本研究参考模式植物拟南芥 TCP 的分类，将20 个烟草 TCP 基因分为 3 个亚类：Class I（PCF）、Class II（CIN）和 Class II（CYC/TB1），这 与 前 人的研究结果一致。根据进化树分析的结果，聚类分析越是相近的基因，说明功能和结构更为相似。保守基序的构成显示，在 20 个 NtTCPs 基因中，共鉴定 10 个保守序列，烟草不同 TCP 基因家族不同亚族之间的保守基序存在差异，基因家族结构上的统一性和变异性，为烟草 TCP 基因行使的功能提供了多样性。目前，顺式作用元件在植物生长发育、植物激素反应和胁迫反应中具有重要的作用。烟草 TCP 基因家族包含了大量的顺式作用元件，光响应的元件（light responsive element），ABA 响应元件、激 素 响 应 元 件（gibberellin-responsive element,salicylic acid responsiveness,MeJA-responsiveness,abscisic acid responsiveness,auxin-responsive）、低 温（low-temperature responsiveness）和防御应激作用元件（defense and stress responsiveness）等。烟草 TCP基因家族亚细胞定位分析显示，烟草 TCP 蛋白位于细胞核中，NtTCPs 基因是烟草重要的一类转录调控基因，可能参与了烟草生长发育和抵抗逆境胁迫的2023,39(6)255张路阳等：烟草 TCP 基因家族的鉴定及表达分析所用数据为 3 个生物学重复的平均值 SD，柱上*表示不同处理间 P0.05 水平差异显著，*表示不同处理间 P0.01 水平差异极显著。下同The data used are the mean SD of three biological replicates.*on the column indicates significant differences in P 0.05 levels among different treatments,while*indicates significant differences in P0.01 levels among different treatments.The same below图 6 烟草 TCP 基因家族在 K326 和 Ti706 不同组织的表达Fig.6 Expressions of tobacco TCP gene family in the different tissues of K326 and Ti706调控过程。目前在茄子9、芹菜27、水稻7、玉米28等启动子中叶含有大量的激素与逆境相关的顺式作用元件。而且这些 TCP 基因与植物生长发育及抵抗逆境胁迫的功能相照应。在水稻中发现，TCP5 基因可以提高对干旱和盐胁迫的耐受性7，TCP19 基因可以影响激素相关合成基因的表达，从而提高转基?Root?Stem?Leaves?Flowers?Bud?Sepal0.000.020.040.060.080.10?Gene expressionNtTCP1K326Ti706?Root?Stem?Leaves?Flowers?Bud?Sepal0.000.020.040.060.080.10?Gene expressionNtTCP2K326Ti706?Root?Stem?Leaves?Flowers?Bud?Sepal0.000.020.040.