牙菌斑检测技术及其应用.pdf

10摇 张郧樊,杨建新 郾 PD鄄1/PD鄄L1 信号通路及其在乳腺癌治疗中的研究进展J.中国医学创新,2017,14(2):145鄄148郾11摇 覃摇 天,邱梅婷,龚智峰 郾 CD48 CD244 介导免疫细胞亚群在乳腺浸润性导管癌不同临床病理因素中的关系J.中国实用内科杂志,2015,35(S1):176鄄177郾12摇 张丽娟,车玉香,高摇伟,等 郾 高碳酸因素对大鼠活化 T 淋巴细胞 CD28/B7 和 CD2/CD48(LFA鄄3)信号转导通路的影响J.哈尔滨医科大学学报,2014,48(6):460鄄463郾13摇 杨摇 鑫,张摇宇,彭路芸,等 郾 CD48 表达可作为区分造血干细胞分裂方式的活性标志J.中国实验血液学杂志,2014,22(3):573鄄579郾14摇 Cui W,Luo Q,Sun SL,et al郾 Efficacy and safety of PD鄄1/PD鄄L1 inhibitors plus chemotherapy for triple鄄negative breastcancer:a systematic review and meta鄄analysis J.Res ProgMed,2022,113(12):郾15摇 Peng C,Li Danni,Zheng Li,et al郾 Chloroquine treatmentinfluences immunological memory through the PD鄄1/PD鄄L1 path鄄way during the initiation of Plasmodium chabaudi infectionJ.International Immunopharmacology,2022,113(PA)郾16摇 Ma Xiaolu,Ding Yongfeng,Qian Jiong,et al郾 NomogramBased on Monocyte鄄to鄄Lymphocyte Ratio to Predict Survival ofUnresectable Esophageal Squamous Cell Carcinoma Who ReceiveFirst鄄Line PD鄄1/PD鄄L1 Inhibitors Combined with ChemotherapyJ.Current oncology(Toronto,Ont郾),2022,29(11).收稿日期:2022鄄12鄄29摇 编校:徐摇 强牙菌斑检测技术及其应用丁博文,段小红,张燕丽摇(军事口腔医学国家重点实验室摇 国家口腔疾病临床医学研究中心摇陕西省口腔医学重点实验室摇 第四军医大学口腔医院口腔生物学教研室,陕西摇 西安摇 710032)关键词摇 牙菌斑;pH 检测;方法;应用基金项目:国家自然科学基金青年项目项目编号:82100958;陕西省自然基金面上项目项目编号:2021JM鄄236通讯作者:张燕丽摇 摇 牙菌斑是牢固黏附于牙面或硬的口腔结构表面的细菌性生物膜,不易被中度水喷冲去,是导致龋病与牙周病的关键因素1,牙菌斑的检测与监测具有重要的临床意义。随着分子生物学和电子显微镜技术等的发展,人们对于牙菌斑的结构与特征有了更深的了解。本文就牙菌斑的传统检测技术、荧光成像技术、pH 检测技术、分子生物学检测技术及其应用作一综述。1摇 牙菌斑的传统检测技术1郾 1摇 菌斑显示剂法:菌斑显示剂通过色素吸附原理使牙菌斑鲜明可见,在视觉上辅助人们定性、定量地判断牙菌斑积累情况。目前牙菌斑显示剂的主要成份有碘、四碘荧光素钠、结晶紫等2,剂型包括片剂、液剂、凝胶剂、牙膏剂、气雾剂等3。此法简单、方便、直观,是最适合民众推广普及的检测方法。1郾 2摇 牙菌斑指数(PLI):该技术是 Silness 和 Loe 于1964 年提出,是依据牙面菌斑厚度评估牙菌斑的指标,用于展示牙菌斑的严重程度,间接评估口腔卫生情况及判断口腔疾病防治效果。目前多采用改良Q鄄H(Quigley鄄Hein)菌斑指数评估法,即牙菌斑计分之和与被检查的牙齿数量的比值:龈缘区无菌斑评估为0 分,龈缘区有少量点状菌斑评估为1 分,牙颈部的菌斑宽度不超过 1 mm 评估为2 分,1 mm菌斑覆盖牙面2/3 评估为 5 分4。将牙菌斑染色与面积、厚度等参数相结合,综合确定牙菌斑指数的等级是目前临床最常用的检测方法。1郾 3摇 菌斑细菌培养法:口腔微生物的种类有上万种,目前可从牙菌斑中分离培养出 700 余种不同的细菌,还有更多菌种在目前条件下尚无法获得纯培养5。菌斑细菌培养法是一种使用选择性培养基使特定细菌增殖的方法,是微生物研究的传统方法。该方法更适用于培养条件要求相对较低的口腔致病菌的检测与鉴定如变异链球菌、具梭核杆菌等。使用选择性培养基鉴定牙菌斑中常见微生物,但不能鉴定未获培养微生物,培养出来的细菌多用于鉴定、科学研究与口腔疾病临床评估。2摇 牙菌斑的荧光成像技术摇 摇 随着光学探测领域的发展,牙菌斑光学检测技术包括数字成像光纤光学透视检测6、光学相干层析成像技术7、扫描仪三维成像技术8、荧光成像技术等,其在临床数据的永久保存方面有着出色的优势。2郾 1摇 菌斑自体荧光成像技术:该技术是基于牙菌斑3232吉林医学 2023 年 8 月第 44 卷第 8 期与牙齿组织在 405 nm 激发光源下具有差异较大的荧光光谱,利用自体荧光这一特性实现牙菌斑含量与分布的无损检测。牙齿组织的激发光谱主要分布于蓝绿波段,牙菌斑的激发光谱主要分布在红色波段,后者与牙菌斑内部厌氧菌产生的卟啉类化合物引起龋坏,最终导致无机物的流失、有机物的分解有关9。Acteon Sopro 相机和定量光诱导荧光数字系统(QLF鄄D)10鄄11是目前使用较多的牙菌斑自体荧光成像系统。基于自体荧光成像的牙菌斑检测方法一方面具有快速、可视、无损的优点,另一方面基于图像颜色,对于诊断临床视诊较难发现的早期牙菌斑意义重大,已成为无损定量检测的主要方向。2郾 2摇 菌斑荧光探针技术:荧光探针是进行牙菌斑检测的重要工具,常用的荧光探针分为标记胞外基质探针,显示细胞活性探针两类。荧光探针所用染料的种类很多包括核酸染料、含荧光素的酶底物、荧光标记的凝集素、荧光标记抗体、碳化聚合物等12鄄13,染料与目标物质结合,随后使用荧光光谱仪或激光共聚焦扫描电镜进行观察。该技术主要用于牙菌斑的特异性胞外基质的成分、结构与活性检测、不同部位菌斑中微生物的活力检测。2郾 3摇 菌斑原位荧光杂交技术:该技术的靶标分子为菌斑微生物的 16S rRNA,使用荧光显微镜或激光共聚焦扫描电镜进行检测,设计合成灵敏性高和特异性强的核酸探针是该技术的关键。主要用于牙菌斑中特定菌株的鉴定14、细胞或细胞器形态观察15、菌斑中不同细菌的动态监测16、菌斑中细菌定位和菌斑整体结构检测17。2郾 4摇 菌斑数字图像分析技术:牙菌斑显色剂染色,荧光成像等获得的图像,需通过图像分析软件如Matlab、Photoshop 及 Image Pro Plus(IPP)等进行图像处理,实现对牙菌斑的定量分析。图像分割技术是数字图像分析技术中最重要的一步,并且研究显示不同菌斑染色方法对图像分割的影响不大,因此可以选用对菌斑更敏感的显色剂进行染色。近年来,基于人工智能技术的数字图像分析技术18鄄19逐渐被用于牙菌斑评估,弥补了临床目视测量的缺陷,但其成本相对较高且有更高的专业要求。3摇 牙菌斑的 pH 检测技术摇 摇 牙菌斑中微生物的产酸代谢活动为龋病的发生发展提供了条件,是导致龋损的直接原因。多项研究证实:菌斑内部呈现不均一的酸性微环境;菌斑的中部和底部较菌斑的上部和外周 pH 值更低;菌斑形成过 程 中 处 于 不 同 阶 段 的 牙 菌 斑 pH 值 不同20鄄22。由此可见,牙菌斑的酸性程度与菌斑深浅、大小和成熟阶段有关,牙菌斑 pH 值可作为判断其致龋力的重要指标。3郾 1摇 接触法牙菌斑 pH 检测技术3郾 1郾 1摇 牙菌斑 pH 试纸检测技术:以 pH 试纸直接接触待测部位,根据试纸颜色变化与 pH 标准板进行比对,获得大致的结果。该技术方便、快捷,适用于椅旁临床检测,但结果易受操作者主观影响。3郾 1郾 2摇 牙菌斑 pH 电极检测技术:直接测量 pH 微型电极插入牙菌斑,一般检测多个部位,并且每个部位重复多次测定,牙菌斑 pH 值记录为多个指定部位重复测量的平均值。该技术检测的是牙菌斑内部或牙菌斑与牙釉质界面的 pH 值,并且可实现对菌斑 pH 的动态监测。但该技术破坏菌斑固有结构且不可用于金属修复体表面检测,加之各种牙菌斑 pH电极制作难度大,成本高,至今临床并未推广。3郾 2摇 非接触法牙菌斑 pH 检测技术3郾 2郾 1摇 牙菌斑 pH 体外检测技术:口腔内采集牙菌斑,将其溶解并进行适当稀释,一段时间内在离体的情况下利用微型玻璃电极等直接测定牙菌斑 pH值23。该方法较为便捷,适用于大样本的调查研究,但会破坏牙菌斑固有结构,也不能对菌斑 pH 进行动态监测。3郾 2郾 2摇Cariostat 龋易感性检测技术:Cariostat 龋易感性检测值也称为龋态值或龋易感性指数,代表牙菌斑中微生物的产酸能力。该技术在上世纪七十年代由日本 Shimono 教授创建,从八十年代中期开始在日本被广泛应用,在我国亦被用于儿童患龋风险评估24鄄25。口腔内采集牙菌斑,将其置于 Cariostat培养基然后体外培养,通过与标准比色卡对比,从而对牙菌斑中致龋菌的产酸能力量化分级。该技术可筛选龋病易感群体,较准确的预测患龋风险。3郾 2郾 3摇 牙菌斑埋藏电极 pH 遥测技术:是将一个微电极如微型玻璃电极、金属氧化物电极等埋入体外牙釉质小块,然后放入患者的义齿中,再将义齿戴入口内,以获得在电极表面形成的菌斑 pH 的动态数据26。适用于牙菌斑不同形成阶段 pH 值的动态检测,但仅局限于单一位点 pH 值检测,同时埋藏法使用的电极构造复杂成本高,并要求患者口腔有足够的空间可容纳电极,因此临床使用范围受限。3郾 2郾 4摇 牙科 pH 光学仪:荧光素的发射光谱随着pH 值的变化而变化,牙科 pH 光学仪利用荧光素的这一光学特性,实现对口腔牙菌斑的 pH 检测26。牙科 pH 光学仪具有口内无接触、多位点、易操作的特点,体现出特有的临床推广价值,但该仪器具有距4232吉林医学 2023 年 8 月第 44 卷第 8 期离和方向依赖性,且 pH 在 5 以下的灵敏度欠佳。3郾 2郾 5摇 激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)技术:是通过激光激发荧光染料或探针,通过分析采集的荧光图像,对菌斑的 pH 进行量化。基于 CLSM 的菌斑pH 检测技术包含荧光衰减成像技术27、pH 敏感染料耦 联 右 旋 糖 酐 技 术28、pH 依 赖 性 染 料 C鄄SNARF鄄4技术28和纳米二氧化硅荧光传感技术29等。CLSM 检测深度为 20 40 滋m,在菌斑垂直梯度的监测中受限,而双光子激光显微镜技术(TPE)使用了比 CLSM 波长更长的激发光,避免了 CLSM对菌斑 pH 垂直梯度检测穿透率不足的缺点,也被应用于牙菌斑 pH 值检测。CLSM 与 TPE 技术可实现对菌斑 pH 值动态监测和菌斑内 pH 值分布检测。3郾 2郾 6摇 高效液相色谱分析:有机酸是菌斑中厌氧菌的代谢产物,牙菌斑中各种有机酸的合成,引起环境pH 变化,与多种口腔疾病密切相关。有机酸的测定方法包括气相色谱法、离子色谱法和高效液相色谱法,而相较于前二者,高效液相色谱分析简便快速、灵敏度高,更适用于牙菌斑中有机酸的微量分析。4摇 牙菌斑的分子生物学检测技术摇 摇 不断发展起来的分子生物学技术,弥补了传统培养方法的不足,更直接地反映了口腔微生物的多样性,为探知口腔微生物结构和功能提供了新方向。牙菌斑分子生物学检测技术对于了解人类自身结构特征、理解口腔微生物与宿主之间的关系、防治口腔疾病和全身疾病都具有重要意义。4郾 1摇 聚合酶链反应技术(PCR):以基因序列为基础的 PCR 技术已被广泛应用,其关键是引物的特异性,该技术多用于牙菌斑中某种微生物的定性分析,鉴别和发现特异种属,此法简便易行,适用于口腔疾病大规模流行病学调查。4郾 2摇 实时荧光定量 PCR 技术:在 PCR 中使用荧光基团,通过对荧光的捕获实现对整个扩增过程实时监测,根据标准曲线定量分析,实现了菌斑微生物从定性到定量的转化30鄄31,具有操作简便、敏感性和特异性高的优势,被广泛应用于牙菌斑中已知细菌的定量检测如龋标志菌乳杆菌的检测,通过定量分析某菌的含量,为临床口腔疾病评估提供参考。4郾 3摇 聚合酶链反应鄄变性梯度凝胶电泳技术(PCR鄄DGGE):通常与 16S rDNA 高通量测序技术联合使用,是一种高质量的 DNA 指纹技术,原理为 DNA 在不同浓度的变性剂中解链不同,使电泳迁移率不同,从而将片段大小不同或者大小相同而碱基组成不同的 DNA 片段分开。DGGE 图谱中不同条带分别代表微生物群落中不同的菌种,条带数反映优势菌的组成多样性。在牙菌斑的研究领域,PCR鄄DGGE 技术被用于检测牙菌斑中微生物的群落组成及其动态变化32鄄33,结合图谱中条带测序,可明确细菌组成。4郾 4摇 16S 核糖体 RNA(16S rRNA)高通量测序技术:16S rRNA 基因有保守区与可变区组成,保守区体现物种间的系统进化关系,可变区体现物种的特异性,是鉴定微生物研究中最常用的分子标志物34。16S rRNA 高通量测序技术利用 IlluminaMiSeq 测序平台对牙菌斑中微生物的 16S rRNA 基因的可变区进行测定,与克隆文库比较,通过可变区的差异对比实现微生物鉴定到种的水平,在不需要微生物分离培养的前提下进行牙菌斑微生物多样性研究35鄄37,一方面可快速、准确地实现牙菌斑微生物的分类鉴定,另一方面菌斑微生物的丰度与结构分析,揭示口腔微生物与疾病之间的群落关系,已成为研究牙菌斑微生物最经济有效的手段。4郾 5摇 宏基因组学技术:宏基因组定义于 1998 年被提出,即特定环境样品中全部微生物的 DNA 总和,亦称为环境微生物基因组、元基因组。该技术首先从牙菌斑中提取 DNA,随后克隆到相应载体中,进一步转化到合适的宿主细胞进而构建基因组文库,最后将长度大小不等的 DNA 序列与数据库内的参考基因组序列进行局部或全局相似性比较,明确牙菌斑中 DNA 片段所属的生物群落。牙菌斑的宏基因组学技术是以研究牙菌斑微生物的多样性、种群组成、功能代谢、进化关系、口腔微生物整体菌落改变与口腔疾病及全身疾病的关系为研究目的,以测序分析和功能基因筛选为研究手段的牙菌斑微生物研究的最有效方法38鄄40。宏基因组学技术应用于牙菌斑中微生物的研究,打破了传统培养法和克隆测序技术研究“非培养冶牙菌斑微生物的障碍,口腔微生物基因遗传信息的进一步获得及口腔微生物群落整体研究是未来趋势。5摇 小结摇 摇 一直以来,牙菌斑检测技术的相关研究极大地提高了人们对于口腔疾病发生机理的认识。本文总结多种检测技术的适用性特点及应用(见图 1):传统检测技术是牙菌斑检测的经典,仍具有不可替代性;牙菌斑 pH 检测对于口腔疾病的防治及流行病学调查具有重要意义;荧光成像技术为临床更加准确地量化牙菌斑提供了依据;测序技术为牙菌斑微生物的研究,口腔疾病的预测和治疗提供依据。该文为广大临床医生及科研工作者提供思路和理论参考。5232吉林医学 2023 年 8 月第 44 卷第 8 期图 1摇 牙菌斑检测技术及其特点6摇 参考文献1摇Wu YF,Salamanca E,Chen IW,et al郾 Xylitol鄄containingchewing gum reduces cariogenic and periodontopathic bacteria indental plaque鄄microbiome investigationJ.Front Nutr,2022,11(9):882636郾2摇Fasoulas A,Pavlidou E,Petridis D,et al郾 Detection ofdental plaque with disclosing agents in the context of preventiveoral hygiene training programsJ.Heliyon,2019,5(7):e2064郾3摇 徐春生,陈丽娜 郾 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