鸭多杀性巴氏杆菌抗体检测胶体金试纸条的研制及应用_程龙飞.pdf

动物医学进展，（）：鸭多杀性巴氏杆菌抗体检测胶体金试纸条的研制及应用收稿日期：基金项目：国家水禽产业技术体系项目（）；福建省科技厅农业科技重大专项项目（）；公益类科研院所专项项目（）作者简介：程龙飞（），男，福建莆田人，研究员，硕士，主要从事家禽传染病防治研究。通讯作者程龙飞，陈红梅，傅光华，江南松，傅秋玲，万春和，黄瑜，刘荣昌，施少华（福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省禽病防治重点实验室福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建福州 ）摘要：为建立快速检测鸭血清多杀性巴氏杆菌抗体的方法，将兔抗鸭 标记胶体金，喷涂金标垫，用浓度为 的荚膜和 羊抗兔 抗体分别作为检测线和质控线，制备了检测鸭多杀性巴氏杆菌抗体的胶体金试纸条（）。特异性试验显示，仅鸭抗多杀性巴氏杆菌血清检测为阳性，阴性血清、鸭抗大肠埃希氏菌、鸭抗鸭疫里默氏菌、鸭抗沙门氏菌和鸭抗金黄色葡萄球菌血清的检测结果均为阴性，表明 的特异性良好。敏感性试验结果显示，对效价（琼脂扩散试验）的鸭抗多杀性巴氏杆菌血清 倍稀释后采用制备的试纸条检测结果仍为阳性，表明 的敏感性较高。重复性试验结果显示，同批次的不同试纸条和不同批次的试纸条，检测阴性血清和鸭抗多杀性巴氏杆菌血清的结果相同，表明 的重复性好。对 份鸭血清采用 和 进行检测，结果显示，阳性符合率为 ，阴性符合率为 ，总符合率为 。结果表明，制备的 操作简单，具有较强的特异性、较高的敏感性和较好的重复性，适合在兽医临床推广应用。关键词：鸭；多杀性巴氏杆菌；胶体金试纸条；荚膜中图分类号：；文献标识码：文章编号：（）禽霍乱又名禽出血性败血症，是由多杀性巴氏杆菌（）引起的主要侵害家禽和野禽的一种慢性或急性接触性、败血性传染病。外表健康的鸡和野生水禽都可能携带多杀性巴氏杆菌，在该病的流行中起重要作用。良好的饲养管理和合理的免疫接种是预防该病的有效方法。抗体水平是评价免疫效果的重要指标，也是制定合理的免疫程序的重要依据。已建立的检测多杀性巴氏杆菌抗体的方法有间接血凝试验、琼脂扩散试验（，）、酶联免疫吸附试验（，）等。间接血凝试验操作简单，敏感性低，结果的判定需要一定的经验，且血凝抗原的稳定性差、保存时间短。操作简便，敏感性低，需要及以上才能得到结果。对大批量血清样品进行快速检测时，这两种方法均存在一定的局限性。特异性强，敏感性高，适用于对大量血清样品的检测，但对检测人员的技术和设备有较高的要求。胶体金免疫层析技术是以胶体金为显色媒介，利用免疫学中抗原抗体能够特异性结合的原理，在层析过程中完成这一反应，从而达到检测的目的，其基本应用形式是胶体金检测试纸条（，），由于检测周期短、成本低、对仪器和人员没有特殊要求，在即时检测方面发挥着不可替代的作用，已广泛应用于动物疾病诊断等领域。本研究以胶体金标记兔抗鸭 喷涂金标垫，提取多杀性巴氏杆菌荚膜作为检测抗原，制备了检测鸭血清中抗多杀性巴氏杆菌抗体的胶体金试纸条（），经检验，特异性强，重复性好，敏感性高于，与 的总体符合率为 ，能满足现场快速检测抗体的需求，适合在基层推广应用。材料与方法材料试验菌株多杀性巴氏杆菌 ，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。试剂粒径 的 胶体金溶液、样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜（膜）、吸收垫、底板和胶体金卡等，福州康和尔生物科技有限公司产品；兔抗鸭 抗体、羊抗兔 抗体，兰博利德（福州）生物技术有限公司产品；羊抗鸭 抗体，美国 公司产品；马丁氏琼脂、马丁氏肉汤，青岛高科技工业园海博生物技术有限DOI:10.16437/ki.1007-5038.2023.06.015公司产品；氯化钠、十二烷基硫酸钠（），国药集团化学试剂有限公司产品；金标抗体保存液（含 、吐温 的 的 ）、金标抗体稀释液（含 、蔗糖的 的 ）、封闭液（含 的 、吐温 的 的 ），本实验室现配现用。从未发生过禽霍乱的种鸭场购买刚出壳雏鸭，隔离饲养，采血制备血清，琼脂扩散试验测定血清的抗体效价，结果为阴性，冰冻保存，作为阴性血清。鸭抗多杀性巴氏杆菌、鸭抗大肠埃希氏菌、鸭抗鸭疫里默氏菌、鸭抗沙门氏菌和鸭抗金黄色葡萄球菌血清，本实验室保存于 冰箱。主要仪器 型生物洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司产品；型恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司产品；型数显恒温水浴锅，青岛聚创环保集团有限公司产品；型高压灭菌器，日本 公司产品；型 离 心 机，日 本 公 司 产 品；型酶标仪，美国 公司产品。方法 多 杀 性 巴 氏 杆 菌 荚 膜 的 提 取取 菌株的冻干粉，划线接种于马丁氏琼脂，培养过夜。挑取圆形露珠样的小菌落个，接种于马丁氏肉汤，培养过夜。每个马丁氏琼脂平板（）接种培养液 ，培养过夜。采用 和 浸提法提取荚膜，以含 的 溶液洗下菌苔，水 浴并不断搅拌，冰 水 浴 冷 却 后 、离心 ，收集上清于蒸馏水中透析，每隔换水次，即为荚膜，采用 超微量分光光度计测定蛋白浓度。兔抗鸭 抗体的胶体金标记标记胶体金的抗体浓度筛选参考文献 方法，将兔抗鸭 抗体的浓度分别调整为、，用 的 溶液将胶体金溶液的 调为，将抗体与胶体金溶液等量混合，室温下搅拌 ，静置 。各加入 溶液 ，继续搅拌 ，静置 。离心 ，取上清液测定其 值。将 值趋于稳定时对应的最小抗体浓度定为兔抗鸭 抗体的最佳浓度。抗体标记胶体金溶液 筛选将兔抗鸭 抗体的浓度调整为最佳浓度，用 的 溶液或 的 溶液将胶体金溶液的 调整为、，将抗体与胶体金溶液等量混合，室温下搅拌 ，静置 。各加入 溶液 ，继续搅拌 ，静置 。离心 ，取上清液测定其 值，以 值接近最大时对应的最小 为标记的最佳。金标抗体的大量制备用 的 溶液将胶体金溶液的 调整至最佳值，兔抗鸭 抗体调整为最佳浓度的倍，二者混合，室温下搅拌 ，静置 ，加入 使其终浓度为，继续搅拌 ，静置过夜。离 心 ，取 红 色 上 清 液，、离心 ，弃上清，沉淀用金标抗体保存液重悬至原体积的，保存。胶体金试纸条的组装金标抗体稀释倍数的确定金标抗体以金标抗体稀释液稀释倍，分别喷涂于金标结合垫上，烘干。荚膜和羊抗兔 抗体分别用 的 溶液调整为，喷涂于 膜上的相应位置，烘干。组装成检测试纸，检测鸭抗多杀性巴氏杆菌血清和阴性血清，比较显色情况，确定金标抗体的稀释倍数。荚膜和羊抗兔 抗体包被浓度的确定金标抗体以金标抗体稀释液进行倍稀释，喷涂于金标结合垫上，烘干。荚膜和羊抗兔 抗体，均以 的 溶液稀释为、，不同浓度组合后喷涂于 膜上的相应位置，烘干。组装成检测试纸，检测鸭抗多杀性巴氏杆菌血清和阴性血清，比较显色情况，确定荚膜和羊抗兔 抗体的使用浓度。组装金标结合垫浸泡于封闭液中，后取出，烘干。金标抗体以金标抗体稀释液稀释倍，按 喷涂于封闭好的结合垫上，烘 干。荚 膜 和 羊 抗 兔 抗 体 分 别 用 的 溶液调整为 ，按 的划线量分别包被于 膜的检测（）线和质控（）线位置，烘干过夜。将样品垫于封闭液中浸泡 后取出，烘干过夜。将样品垫、金标结合垫、膜和吸水纸首尾相连依次粘贴在 底板上，然后切割成 宽的试纸条，装于胶体金卡中，此即为本研究制备的检测鸭血清抗多杀性巴氏杆菌抗体的胶体金试纸条（）。胶体金试纸条的使用方法及结果判定待检动物医学进展 年第 卷第期（总第 期）血清样品，用 进行 倍稀释，滴滴（大约 ）于检测孔（）中，左右肉眼观察结果。线对应处没有出现红色，表明试纸条已失效，放弃；线变红色而 线没有变红色，判定为阴性结果；线变红色且 线变红色，判定为阳性结果。胶体金试纸条的特异性试验用 对阴性血清、鸭抗多杀性巴氏杆菌、鸭抗大肠埃希氏菌、鸭抗鸭疫里默氏菌、鸭抗沙门氏菌和鸭抗金黄色葡萄球菌血清进行检测，根据结果判定该方法的特异性。胶体金试纸条的敏感性试验参考文献方法建立 法测定鸭抗多杀性巴氏杆菌血清的效价，取份效价为 的血清，用 倍稀释，然后倍比稀释至 ，用胶体金试纸条检测各稀释度样品，根据结果分析该方法的敏感性。胶体金试纸条的重复性试验取 批次的 条，对鸭抗多杀性巴氏杆菌血清和阴性血清进行检测，每个样品重复次；另取 和 批次的 各条，对上述血清进行检测。根据结果分析该方法的重复性。胶体金试纸条与酶联免疫吸附试验的符合率比较以的荚膜蛋白包被 板，参考文献 方法建立检测血清抗体的间接 法，血清的稀释度为 ，羊抗鸭 抗体的使用浓度为 。份实验室保留的鸭血清，分别用间接 法和 进行检测，对结果进行分析。胶体金试纸条的应用从个免疫过禽霍乱疫苗（免疫后个月至个月）的蛋鸭场，共采集血清 份。未免疫过禽霍乱疫苗的蛋鸭场和肉鸭场共个，合计采 集血 清 份。所有血 清 均 用 进行检测，对结果进行分析。结果兔抗鸭 抗体的胶体金标记小剂量试验结果表明，兔抗鸭 抗体与胶体金作用后，随着抗体浓度的增加，溶液的 值逐渐上升并稳定在之间，当 值趋于稳定时对应的最小抗体浓度为（图），为 确 保 标 记 效 果，将 该 浓 度 的 倍 即 作为大量制备金标抗体时的抗体浓度。兔抗鸭 抗体与不同 的胶体金溶液混合处理后，上清液的 值见表，确定抗体标记的最佳 为。胶体金试纸条的组装不同金标抗体稀释后制备的试纸条，检测阳性血清和阴性血清的结果见图，羊抗兔 抗体为 时，不同浓度荚膜制备的试纸条，检测阳性血清和阴性血清的结果见图。优化试验结果显示，金标抗体的稀释倍数为倍，线上荚膜的使用浓度为，线上羊抗兔 抗体的使用浓度为。图兔抗鸭 浓度的筛选结果 表抗体标记胶体金溶液 的筛选结果 试纸条与阳性血清反应，金标抗体的稀释倍数分别为、；试纸条与阴性血清反应，金标抗体的稀释倍数分别为、，；，图胶体金试纸条金标抗体浓度的筛选试验结果 胶体金试纸条的特异性试验结果 对阴性血清，鸭抗多杀性巴氏杆菌、鸭抗大肠埃希氏菌、鸭抗鸭疫里默氏菌、鸭抗沙门氏菌和鸭抗金黄色葡萄球菌血清的检测结果，除鸭抗多杀性巴氏杆菌血清为阳性外，其余均为阴性（图），说明胶体金试纸条的特异性好。胶体金试纸条的敏感性试验结果份 效价为 的鸭抗多杀性巴氏杆菌血清，用 倍稀释，然后倍比稀释后用胶体程龙飞等：鸭多杀性巴氏杆菌抗体检测胶体金试纸条的研制及应用金试纸条进行检测，及以下稀释度血清的检测结果为阳性，和 的检测结果为阴性（图）。表明胶体金试纸条具有较高的敏感性。试纸 条 与 阳 性血清反应，荚膜浓度分别为 、；试纸条与阴性血清反应，荚膜浓度分别为、，；，图胶体金试纸条荚膜浓度的筛选试验结果 阴性血清；鸭抗大肠埃希氏菌血清；鸭抗鸭疫里默氏菌血清；鸭抗沙门氏菌血清；鸭抗金黄色葡萄球菌血清；鸭抗多杀性巴氏杆菌血清 ；图胶体金试纸条的特异性试验结果 鸭抗多杀性巴氏杆菌血清稀释倍数分别为、，图胶体金试纸条的敏感性检测结果 胶体金试纸条的重复性试验结果对鸭抗多杀性巴氏杆菌血清和阴性血清进行检测，批次的不同 之间的比较，结果相同；批次与 、批次的 比较，结果也相同。说明 的重复性好。胶体金试纸条与酶联免疫吸附试验的符合率 份 实 验 室 保 留 的 鸭 血 清 用 和 检测，结果见表。阴性的血清有 份，也 全 为 阴 性，与 的 符 合 率 为 ，说明 对阴性血清的检测结果是准确的。检测结果阳性的血清有 份，阳性的有 份，阴性的有份，与 的符合率为 ，说明有一小部分阳性血清，用 检测不出来，存在漏检的情况。份血清，与 的符合率为 ，说明 还是具有很高的准确性。表胶体金试纸条与 方法的符合率比较 项目 酶联免疫吸附试验 阴性 阳性 胶体金试纸条阴性 胶体金试纸条阳性 合计 胶体金试纸条的应用 份免疫过禽霍乱疫苗的鸭血清，检测阳性的有 份（），只有份检测为阴性。说明 可以用于禽霍乱疫苗免疫后的抗体检测和监测。份未免疫过禽霍乱疫苗的鸭血清，检测阳性的有 份（），说明鸭场存在一定程度的多杀性巴氏杆菌自然感染现象。讨论胶体金免疫层析技术具有技术要求不高、简便快速、结果易于判读等优点，同时也存在检测通量低、偶有假阴性结果等不足之处，只能进行定性检测或半定量检测，在动物疾病的应用领域常用于疾病的快速筛查、抗体的现场快速检测等。间接捕获法是胶体金免疫层析检测方法的一种，主要用于血清中抗体的检测，在硝酸纤维素膜上包被纯化或者重组抗原作为检测线，以胶体金颗粒标记 或者 等做为金标抗体。该方法通常需要过量的胶体金溶液，且样品在检测前需要进行稀释或者加入一定量的缓冲液。以细菌或细菌成分作为检测线抗原，已有成功的报道。刘洁等 以胶体金标记羊抗鼠 ，以 的大肠埃希氏菌 全菌抗原、细菌的单克隆抗体包被于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线，组装成胶体金试纸条，与常规间接 的敏感度相当。唐景峰 和吴志强等 提取动物医学进展 年第 卷第期（总第 期）光滑型布鲁菌的脂多糖，纯化后作为检测抗原，以胶体金标记葡萄球菌蛋白作为金标抗体，组装的胶体金试纸条，可以检测牛和羊血清中的布鲁菌抗体。本研究以 的多杀性巴氏杆菌荚膜包被 膜，以胶体金标记兔抗鸭 抗体，制备了检测鸭血清中多杀性巴氏杆菌抗体的胶体金试纸条，经检验，特异性强、重复性好，敏感性比 法高 倍，与 的符合率为 。制备的胶体金试纸条可用于现场对鸭免疫禽霍乱疫苗后的抗体水平进行快速检测，以评价疫苗的免疫效果。参考文献：，：，（）：，：，（）：，：刘畅，杨琳燕，王艺霞，等免疫层析技术研究及应用动物医学进展，（）：林世棠，陈月英，陈萍，等禽多杀性巴氏杆菌荚膜亚单位疫苗对鸭的免疫研究福建省农科院学报，（）：程龙飞，张长弓，傅秋玲，等 检测水禽源细小病毒的胶体金试纸条的研制中国预防兽医学报，（）：秦翠丽 豫西地区兔巴氏杆菌病病原特性与 检测技术研究江苏南京：南京农业大学，（）：周华倩 牛支原体抗体检测胶体金免疫层析试纸条的研制及初步应用甘肃兰州：中国农业科学院，刘洁，夏兴霞，王永山，等 大肠杆菌 ：抗体胶体金免疫层析检测试纸条的研制中国预防兽医学报，（）：唐景峰 布鲁氏菌种特异性抗原抗体免疫胶体金试纸条的研制及初步应用吉林长春：吉林大学，吴志强，刘少蓉，白民俊，等种布鲁菌抗体检测试纸条快速检测方法的建立中国兽医学报，（）：，（，）：，（）（），（），（），：；程龙飞等：鸭多杀性巴氏杆菌抗体检测胶体金试纸条的研制及应用