秀珍菇多肽的制备及其抗氧化活性_武少兰.pdf

收稿日期:20220428修回日期:20220606基金项目:福建农林大学科技创新项目(CXZX2020116A)作者简介:武少兰(1995)，女研究方向:食用菌Email:1579748375 qqcom通信作者江玉姬(1965)，女，教授研究方向:农产品贮藏与保鲜、食品生物技术、有效成分提取与纯化Email:jyj1209 163com秀珍菇多肽的制备及其抗氧化活性武少兰1，张芳艺1，罗小芳1，李昕霖2，吴敏文3，郑舒桓1，杨成龙4，江玉姬1(1福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002;2福建省食用菌技术推广总站，福建 福州 350003;3福州市农业局，福建 福州 350025;4福建省农业科学院农业工程技术研究所，福建 福州 350001)摘要:以多肽得率为指标，酶解秀珍菇蛋白质制备多肽，通过正交试验优化制备工艺正交试验结果表明，酶解各因素对秀珍菇多肽得率影响程度的大小为:pH时间温度酶浓度;确定的最佳酶解工艺参数为:pH 11、时间 15 h、温度 55、碱性蛋白酶浓度 6 000 Ug1，制备的多肽得率为 7096%;体外抗氧化能力测定结果表明:25 mgmL1秀珍菇多肽对 DPPH、ABTS+和羟基自由基的清除率分别为 8157%、9981%、9884%;SDS-PAGE 检测结果表明，秀珍菇多肽的分子质量约为58 ku;氨基酸分析结果表明，秀珍菇多肽含有 8 种必需氨基酸，占氨基酸总量的 432%综上，在最佳酶解工艺下制备的秀开放科学(资源服务)标识码(OSID)珍菇多肽具有分子质量低且抗氧化能力强的特点关键词:秀珍菇多肽;蛋白质酶解;抗氧化性中图分类号:S6461+4;TQ9361+6文献标识码:A文章编号:1671-5470(2023)03-0408-07DOI:1013323/jcnkijfafu(natsci)202303017Preparation and antioxidant activity of Pleurotus geesteranus polypeptidesWU Shaolan1，ZHANG Fangyi1，LUO Xiaofang1，LI Xinlin2，WU Minwen3，ZHENG Shuhuan1，YANG Chenglong4，JIANG Yuji1(1College of Food Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China;2FujianEdible Fungi Technology Promotion Station，Fuzhou，Fujian 350003，China;3Fuzhou Agricultural Bureau，Fuzhou，Fujian 350025，China;4Institute of Agricultural Engineering and Technology，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou，Fujian 350001，China)Abstract:Polypeptides yield was used as the index to optimize the enzymolysis technology for the extraction of polypeptides fromPleurotus geesteranus protein by orthogonal experiment design The results showed that the influences of the factors on polypeptidesyield were as follows:pHtimetemperatureenzyme And the optimal polypeptides yield(7096%)was achieved with 6 000 Ug1alkaline protease and hydrolyzation at 55 and pH 11 for 15 h The scavenging ability of 25 mgmL1Pgeesteranus polypep-tides in vitro to DPPH，ABTS+and hydroxyl radicals were 8157%，9981%and 9884%，respectively The SDS-PAGE resultsshowed that the molecular mass of the polypeptides was about 58 ku And the 8 essential amino acids in the polypeptides accountedfor 432%of the total amino acids Therefore，Pgeesteranus polypeptides prepared from the optimized condition are featured by lowmolecular weight and high antioxidant capacityKey words:Pleurotus geesteranus polypeptides;protein enzymatic digestion;antioxidant properties秀珍菇(Pleurotus geesteranus)又称小平菇和姬菇，在我国福建、广东、山西、黑龙江和吉林等省份大量栽培12 秀珍菇外形美观、营养丰富、口感柔和、香味浓郁3，富含蛋白质和多糖，还含有黄酮、多酚和多种微量元素4，具有抗氧化、抗肿瘤和免疫调节作用2 吕建敏等5 研究表明，秀珍菇对 H22 荷瘤小鼠模型肿瘤抑制率达到 4880%;Song et al67 研究表明，秀珍菇菌丝体多糖对大鼠急性酒精性肝损伤具有降低脂质堆积和炎症因子的作用目前，秀珍菇主要是新鲜销售，品种单一，产业链短，需要开发深加工产品秀珍菇含有大量的蛋白质，约占干菇的 30%，然而一直以来的研究对象主要是秀珍菇多糖，对秀珍菇蛋白质福建农林大学学报(自然科学版)第 52 卷 第 3 期Journal of Fujian Agriculture and Forestry University(Natural Science Edition)2023 年 5 月的研究很少多肽作为一种生物活性物质，具有抗氧化、消炎、降血糖、抑菌和抗肿瘤的作用89，目前，香菇、杏鲍菇、蛹虫草和竹荪等食用菌中的多肽及其抗氧化性已有报道1011，但秀珍菇多肽还没有相关的报道据此，本研究先提取秀珍菇的蛋白质，再通过酶解蛋白质制备多肽，并测定多肽的抗氧化能力，旨在为研究秀珍菇多肽的生理功能，开发秀珍菇的深加工产品，拓展秀珍菇的产业链提供依据1材料与方法11材料111原材料新鲜秀珍菇购于福建省漳州市新发生物科技有限公司112试剂超低分子质量(33201 ku)预染蛋白质 Marker 购于北京 Solarbio 公司;LabPAGE 预制胶(20%)购于北京兰博利德商贸公司;碱性蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶购于上海源叶生物有限公司;甲醇、冰乙酸、2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、过硫酸钾、邻苯三酚、硫酸亚铁、双氧水、水杨酸、铁氰化钾、三氯乙酸(TCA)等购于国药集团113仪器设备主要仪器设备有 L-8900 氨基酸自动分析仪 天美(中国)科学仪器有限公司、205 旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)、DL-5-B 离心机(厦门精艺兴业科技有限公司)、LGJ-12 真空冷冻干燥机(北京松源有限公司)、DYY-12C 电泳仪(北京六一仪器厂)、SpectraMaxi 3X 功能酶标仪(美国 MolecularDevices 公司)12秀珍菇蛋白质的提取秀珍菇于 50 恒温烘干粉碎后过 60 目筛称取一定量的秀珍菇粉末放入烧杯中，按照 1 40(g mL)的料液比加入蒸馏水并用 1 molL1NaOH 调节 pH 至 11，于 55 水浴提取 4 h 后，再于 4 500 rmin1离心 10 min取上清液，用 1 molL1HCl 调节 pH 至 58，于冰箱放置 12 h，再于 4 500 rmin1离心10 min收集蛋白质沉淀，冷冻干燥后即为秀珍菇蛋白质，经过考马斯亮蓝测得提取的蛋白质质量分数为674 mgg113秀珍菇多肽制备流程制备流程:秀珍菇蛋白质酶解沸水中灭酶5 min加酸沉淀蛋白质于 5 000 rmin1离心10 min取上清液蒸发浓缩冷冻干燥秀珍菇多肽14秀珍菇多肽最佳酶解工艺参数的确定141单因素试验蛋白质在酶解的过程中受料液比、酶的种类、酶浓度、时间、温度和 pH 等因素的影响12 因此，考察酶的种类(复合蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶)、料液比 1 10、1 20、1 30、1 40、1 50(g mL)、酶浓度(2 000、4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 Ug1)、时间(05、10、15、20、25、30 h)、温度(45、50、55、60、65、70)和 pH(8、9、10、11、12、13)对秀珍菇多肽得率的影响，分别进行单因素试验，以确定最佳的因素水平142正交试验在单因素试验的基础上，以 pH、酶浓度、温度、时间 4 个因素为自变量，以多肽得率为指标，筛选最佳的提取条件设计的 5 因素 4 水平正交试验如表 1 所示表 1正交试验因素水平表Table 1Factors and levels of orthogonal experiment序号pH(A)碱性蛋白酶浓度Ug1(B)(酶解)/(C)t(酶解)/h(D)空白(E)1104 000450512116 000501023128 0005515341310 0006020415秀珍菇多肽得率的测定采用双缩脲法测定，参考周燕芳等13 的方法配制双缩脲试剂准确称取 10 g 酪蛋白，用蒸馏水配制质904第 3 期武少兰等:秀珍菇多肽的制备及其抗氧化活性量浓度为 10 mgmL1的母液取 7 个试管，分别吸取 0、01、02、04、06、08、10 mL 酪蛋白母液，加水至1 mL，摇匀，每管再加入 4 mL 双缩脲试剂充分混合，于室温下放置 30 min，再于 540 nm 波长处检测各样品的光密度(D)以多肽含量为 x 轴，D540 nm为 y 轴，绘制的标准曲线方程为:y=0047 9x+0070 1(2=0999)制备好的秀珍菇多肽液以 1 1 的体积比加入质量分数为 15%的 TCA，充分混匀静置 30 min 后，于5 000 rmin1离心 10 min取 1 mL 上清液，加入 4 mL 双缩脲试剂混匀静置 30 min 后，在 540 nm 波长处测定 D 值根据标准曲线方程(y=0047 9x+0070 1)计算多肽含量(秀珍菇蛋白质酶解前多肽的质量分数为 112%)多肽得率/%=(酶解后的多肽含量稀释倍数酶解前的多肽含量稀释倍数)/总蛋白质含量10016秀珍菇多肽指标的测定161抗氧化能力的测定秀珍菇多肽对 DPPH 自由基的清除能力按 Latorres et al14 的方法测定，对羟基自由基的清除能力按齐希光等15 的方法测定，对 ABTS+自由基的清除能力按王荣等16 的方法测定自由基清除率/%=1(AiAj)/A0 100式中:Ai为样品溶液的 D540 nm，Aj为样品参比溶液的 D540 nm，A0为空白溶液的 D540 nm162分子质量的测定采用 SDS-PAGE 检测秀珍菇多肽的分子质量电泳时选择 20%预制胶，1 mgmL1待测样品用上样缓冲溶液(含 100 mg SDS、01 mg 羟基乙醇、1 mL 甘油、2 mg 溴酚蓝、05 mL 磷酸缓冲液，加双蒸水至 10 mL)溶解，电泳前沸水浴 5 min，离心取上清液上样量为 15 L，电泳于恒压 100 V 下进行用 025%考马斯亮蓝-250 进行凝胶染色，脱色液中甲醇、冰醋酸、水的体积比为 4 1 517 凝胶染色和脱色后进行拍照163基本组分和氨基酸组成的测定秀珍菇多肽中的蛋白质、灰分、水分等基本组分含量及氨基酸组成由福建省农业科学院测试中心测定17数据处理试验数据采用 SPSS 180 软件进行统计分析2结果与分析图 1蛋白酶种类和酶解时间对秀珍菇多肽得率的影响Fig1Effect of enzyme type and enzymatic digestion timeon the yield of P geesteranus polypeptides21秀珍菇蛋白质酶解制备多肽的单因素试验结果211蛋白酶种类和酶解时间对秀珍菇多肽得率的影响在料液比为 1 30(g mL)和酶浓度为 6 000Ug1的条件下，分别加入复合蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和胰蛋白酶，在各自最适的酶解条件下酶解 1、2、3、4、5 h，制备秀珍菇多肽，测定多肽得率由图 1 可知，采用碱性蛋白酶制备的多肽得率明显高于其他 5 种酶，且酶解时间为12 h 时，多肽得率随着酶解时间的增加而增大，但酶解时间继续延长时多肽得率有所减少采用菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶制备的多肽得率最低，采用胰蛋白酶、复合蛋白酶和中性蛋白酶制备的多肽得率较低因碱性蛋白酶酶解 1 5 h 时制备的多肽得率为5325%5649%，变化幅度较小，故选取 03 h 进行进一步试验212料液比对秀珍菇多肽得率的影响以 1 10、1 20、1 30、1 40、1 50(g mL)的料液比添加6 000 Ug1碱性蛋白酶，在 pH 为 10、温度为 55 的水浴条件下反应 2 h，制备秀珍菇多肽，测定多肽得率由图 2A 可知，随着料液比的不断增大，多肽得率显著上升，表明底物与酶充分接触，多肽得率增大料液比为 1 30、1 40、1 50(g mL)时的多肽得率分别为 5234%、5447%、5572%，即料液比高于 1 30(g mL)时，随着料液比的增大，多肽得率增加速度变缓，且料液比增大，后续蒸发浓缩难度加大，因此选择 1 30(g mL)为最佳料液比014福建农林大学学报(自然科学版)第 52 卷213碱性蛋白酶浓度对秀珍菇多肽得率的影响由图 2B 可知，碱性蛋白酶浓度对秀珍菇多肽得率的影响明显碱性蛋白酶浓度为 2 0006 000 Ug1时，多肽得率随着蛋白酶浓度的增加而增大;碱性蛋白酶浓度为 6 0008 000 Ug1时，多肽得率变化不明显;当碱性蛋白酶浓度大于 8 000 Ug1时，多肽得率显著下降碱性蛋白酶浓度为 2 0006 000 Ug1时，由于底物充足，蛋白酶含量较少，多肽得率会随着蛋白酶浓度的增加而逐渐增大;当碱性蛋白酶浓度为 6 000 Ug1时，多肽得率最大，达到5274%;但继续增加蛋白酶浓度时，由于底物不足，多肽得率不再增大18 因此选择 6 000 Ug1作为最佳碱性蛋白酶浓度214pH 对秀珍菇多肽得率的影响由图 2C 可知，随着 pH 的升高，秀珍菇多肽得率呈先增加后减少的趋势pH 为 11 时，多肽得率为 5555%，这时蛋白酶的活性较高，多肽得率达到最高点;随着 pH 进一步加大，蛋白酶会逐渐失去活性因此选择 11 为最佳 pH215酶解时间对秀珍菇多肽得率的影响由图 2D 可知，随着酶解时间的延长，秀珍菇多肽得率呈先增大后减小的趋势酶解 15 h 时，多肽得率最大，为 5839%;但随着反应的继续，多肽得率逐渐下降这可能是随着酶解时间的增加，底物蛋白质被完全酶解，多肽含量不再增大，长时间的浸提甚至会导致一些肽键断裂，从而影响多肽得率19 因此选择 15 h 为最佳酶解时间216酶解温度对秀珍菇多肽得率的影响由图 2E 可知，在一定的温度范围内，随着酶解温度的升高，秀珍菇多肽得率呈先增大后减小的趋势当酶解温度为 60 时，多肽得率达到最大值，为 6362%;当酶解温度超过 60 时，多肽得率呈下降趋势可见，在酶解过程中，适当升高温度可以提高酶活性，促进蛋白质水解，但温度过高，酶蛋白开始变性，酶解的效率就会下降20 因此选择 60 为最佳酶解温度A:料液比;B:碱性蛋白酶浓度;C:pH;D:时间;E:温度不同字母表示差异显著(P005)，相同字母表示差异不显著(P005)图 2酶解因素对秀珍菇多肽得率的影响Fig2Effect of various enzymolysis factors on the yield of Pgeesteranus polypeptides22秀珍菇蛋白质酶解制备多肽的正交试验结果在单因素试验的基础上，料液比恒定为 1 30(g mL)的条件下，以多肽得率为指标对秀珍菇蛋白质酶解制备多肽的条件进行优化正交试验结果(表 2)显示，4 个因素对秀珍菇多肽得率影响程度为:ADCB，最佳条件组合为 A3B3C2D3，即 pH 11，碱性蛋白酶浓度 6 000 Ug1，温度 55，时间15 h114第 3 期武少兰等:秀珍菇多肽的制备及其抗氧化活性表 2正交试验结果Table 2esults of orthogonal test序号因素pH(A)碱性蛋白酶浓度Ug1(B)(酶解)/(C)t(酶解)/h(D)空白(E)多肽得率/%192 000500512739294 000551023393396 000601533457498 0006520431465102 0005515451096104 0005020338977106 0006505248408108 0006010143369112 00060202487310114 00055151617011116 00050104542012118 00065053641713122 00055103288914124 00060054366115126 00065201371416128 000501523832k1j34534172424146944518k2j48234549493842874501k3j60004627435949114445k4j37944531453141774603j2667550697735158主次顺序ADCB优水平A3B3C2D3正交试验方差分析结果(表 3)显示，pH(A)对秀珍菇多肽得率的影响极显著，酶解时间(D)、酶解温度(C)和碱性蛋白酶浓度(B)对多肽得率的影响显著采用最佳工艺制备秀珍菇多肽，多肽得率 3 次测定的平均值为 7096%表 3正交试验方差分析结果1)Table 3Variance analysis on orthogonal test results因素偏差平方和自由度均方F显著性A1 5775135258430740 B6841322801333*C11250337502192*D14380347932802*误差51331711)*表示差异显著(P005)，表示差异极显著(P001)23秀珍菇多肽的抗氧化能力231对羟基自由基的清除率羟基是一种非常活跃的自由基，具有很强的侵略性，被认为是最有毒的活性氧自由基，可以对生物造成过氧化破坏21 从图 3A 可知，秀珍菇多肽对羟基自由基有很强的清除能力，且与多肽含量呈正相关当秀珍菇多肽的质量浓度为 25 mgmL1时，对羟基自由基的清除率达到9884%，略低于同含量 VC的清除率，高于采用杏鲍菇柄22、蛹虫草23 和猴头菇24 制备的多肽对羟基自由基的清除率232对 DPPH 自由基的清除率DPPH 自由基是一种脂质自由基的模型化合物，是评估自由基清除活性的关键指标之一25 从图 3B 可知，随着秀珍菇多肽含量的增加，对 DPPH 自由基的清除能力也逐渐增大当秀珍菇多肽的质量浓度为 25 mgmL1时，对 DPPH 自由基的清除率达到 8157%，低于同含量 VC的清除率，与采用杏鲍菇柄22、蛹虫草23 和猴头菇24 制备的多肽对 DPPH 自由基的清除率相当214福建农林大学学报(自然科学版)第 52 卷233对 ABTS+自由基的清除率ABTS+是一种人工合成的自由基，结构更稳定，操作更方便从图 3C 可知，秀珍菇多肽的质量浓度为 25 mgmL1时，对 ABTS+自由基的清除率达到 9981%，接近同含量 VC的清除率，高于采用鲫鱼26 和鹿角27 制备的多肽对 ABTS+自由基的清除率图 3秀珍菇多肽对羟(A)、DPPH(B)和 ABTS+(C)自由基的清除率Fig3Scavenging rates of hydroxyl(A)，DPPH(B)and ABTS+(C)radical by Pgeesteranus polypeptidesM:33201 ku 超低分子质量预染蛋白质 Marker;A1、A2:秀珍菇多肽图 4秀珍菇多肽 SDS-PAGE 电泳图谱Fig4SDS-PAGE electrophoresis profile of Pgeesteranus polypeptides24秀珍菇多肽的分子质量SDS-PAGE 检测结果(图 4)显示，秀珍菇多肽2 份样品 A1、A2 的最大分子质量约为 5 8 ku刘思杉等28 研究表明，秀珍菇蛋白质的分子质量为 324403 ku表明秀珍菇蛋白质经过酶解后，其分子质量降低 80%左右25秀珍菇多肽的基本组分及氨基酸组成采用最佳工艺制备的秀珍菇多肽含 746%蛋白质、118%灰分、85%水分、51%其他成分秀珍菇多肽富含 17 种氨基酸，其中，天门冬氨酸占比 1046%，苏氨酸占比 520%，丝氨酸占比485%，谷氨酸占比 1451%，甘氨酸占比 508%，丙氨酸占比 695%，胱氨酸占比 070%，缬氨酸占比 635%，蛋氨酸占比 302%，异亮氨酸占比 536%，亮氨酸占比 839%，酪氨酸占比 400%，苯丙氨酸占比 504%，赖氨酸占比 733%，组氨酸占比 255%，精氨酸占比618%，脯氨酸占比 403%秀珍菇多肽包含缬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸 8 种必需氨基酸，必需氨基酸占氨基酸总量的 4324%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值为7618%，符合联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)对优质蛋白质的要求谷氨酸(1451%)和天门冬氨酸(1046%)是秀珍菇多肽中最丰富的氨基酸研究表明:谷氨酸、天门冬氨酸与抗氧化能力呈正相关29;也是中枢神经系统中重要的兴奋性神经递质，是哺乳动物肠道细胞中腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的重要来源，并可以通过脱羧和转氨转化为其他营养物质，在体内发挥作用30 由此可知秀珍菇多肽的营养价值较高3结论秀珍菇多肽最佳酶解工艺参数为:pH 11、碱性蛋白酶浓度 6 000 Ug1、温度 55、时间 15 h;采用最佳酶解工艺制备的秀珍菇多肽得率为 7096%，其分子质量最大，约为 58 ku;秀珍菇多肽抗氧化能力强，25 mgmL1多肽对 DPPH、ABTS+和羟基自由基的清除率分别达到 8157%、9981%、9884%本研究结果可为后续将秀珍菇多肽开发为功能性食品和药品提供参考314第 3 期武少兰等:秀珍菇多肽的制备及其抗氧化活性参考文献 1陈国龙，秦延春，卢玉文，等不同培养料对秀珍菇生长发育及主要营养成分的影响 J 食用菌，2018，40(6):3334，49 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动物营养学报，2017，29(11):38633869(责任编辑:施晓棠)414福建农林大学学报(自然科学版)第 52 卷