新藤黄酸增强仑伐替尼在肝细胞癌中的敏感性及其机制研究_庞梦迪.pdf

新藤黄酸增强仑伐替尼在肝细胞癌中的敏感性及其机制研究庞梦迪，孙靖，贾步云，张忠伟，杨奇奇，陈卫东，唐丽琴（安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 ；安徽医科大学第一附属医院药学部，安徽 合肥 ；安徽中医药大学中西医结合学院，安徽 合肥 ；省部共建安徽道地中药材品质提升协同创新中心，安徽 合肥 ；中药复方安徽省重点实验室，安徽 合肥 ；中国科学技术大学附属第一医院，安徽 合肥 ）摘要 目的探究新藤黄酸（，）协同仑伐替尼对肝细胞癌的抑制、促进肝细胞癌的凋亡作用及其机制。方法采用 肝癌细胞建立 移植瘤小鼠模型，将模型复制成功的小鼠随机分为模型组（生理盐水），组（），仑伐替尼组（），（）仑伐替尼（）组，每组 只，各组小鼠给予相应药物连续灌胃周，每日次；比较各组小鼠的肿瘤质量和体质量，观察联合仑伐替尼对肿瘤生长的作用；苏木精伊红染色观察联合仑伐替尼对移植瘤模型小鼠各脏器的影响；染色检测移植瘤模型小鼠肿瘤组织中细胞凋亡情况；检测移植瘤模型小鼠肿瘤组织中孕烷 受体（，）、糖蛋白（，）、乳腺癌耐药蛋白（，）、细胞色素 酶（，）、淋巴细胞瘤（，）、相关蛋白（，）、蛋白的表达水平。结果与模型组比较，仑伐替尼组肿瘤生长得到明显抑制（.），并且优于组和仑伐替尼组（.）；给药后小鼠的主要器官（心、肝、脾、肺、肾）均未出现明显病变；与模型组比较，各给药组均发生明显的细胞凋亡，仑伐替尼组细胞凋亡较仑伐替尼组更加明显；仑伐替尼组肿瘤组织中 、的蛋白表达水平显著降低（.），、蛋白表达水平显著上升（.）。结论与仑伐替尼联用可以发挥协同作用，增强仑伐替尼对肝细胞癌的敏感性，其分子机制可能与下调核受体 的表达水平，从而影响代谢酶 ，转运体，和凋亡蛋白 、的表达有关。关键词 新藤黄酸；仑伐替尼；肝细胞癌 中图分类号 肝细胞癌（，）是最常见的原发性肝癌，是全球第三大癌症相关死亡原因。目前，治疗 的主要手段有肿瘤病灶切除、化学治疗、放射治疗和肝移植等。由于 前期无典型症状，并且缺乏特异性诊断该病的生物学标志物，患者确诊时多已发展至中晚期，手术治疗的机会降低。仑伐替尼是一种新型的 一线治疗药物，在 年被美国食品药品监督管理局批准用于 的治疗，已被证实可显著改善晚期 的无进展生存期。临床试验发现，与采用索拉菲尼治疗的晚期肝癌患者比较，采用仑伐替尼治疗的晚期肝癌患者总生存期更长。然而，由于原发性或适应性耐药，靶向治疗的耐药情况不容忽视，基金项目：国家自然科学基金项目（）；安徽中医药大学科研基金项目（）作者简介：庞梦迪（），女，硕士研究生通信作者：唐丽琴（），女，博士，教授，尽管仑伐替尼是晚期 治疗的理想靶向药物，但其治疗的总有效率只有，并且已有研究报道仑伐替尼耐药病例。仑伐替尼耐药成为改善肝癌患者预后的主要障碍，除了迫切需要阐明肝癌患者仑伐替尼耐药的机制外，另一个策略是寻找可能使仑伐替尼在 治疗中敏化的候选药物。有研究 表明，临床上采用仑伐替尼联合抗程序性死亡受体药物派姆单抗、仑伐替尼联合吉非替尼治疗 患者，均取得良好的治疗效果。联合用药是目前非常具有前景的肿瘤治疗策略，选用作用机制不同的两种药物联用，发挥协同作用，可提高疗效而不增加毒性，同时减少耐药现象的产生，对提高靶向药物敏感性具有重要的临床意义。近年来，中药抗肿瘤作用在临床上应用得到重视，大量临床和实验研究表明，中药辅助治疗肿瘤是一种安全、有效的途径。中医药在抗恶性肿瘤治疗领域取得了一定进展，尤其是在减毒增效、逆转肿瘤细胞的多药耐药方面，可以达到减轻毒性、增加疗 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 效的目的，从而使患者更好地完成规范化治疗。藤黄是藤黄科植物藤黄的干燥树脂，具有攻毒蚀疮、破血 散 结 等 功 效。新 藤 黄 酸（，）是从中药藤黄中分离出来的重要活性成分，现代研究 表明，作为藤黄中的活性成分之一，具有良好的抗肿瘤活性。具有多种抗癌活性，因此其作为潜在的抗癌药物，得到了越来越多的关注。课题组先前的研究 表明，在 细胞的体外药效学实验中，无毒剂量的可以通过抑制 和蛋白表达而成为 结合转运蛋白（，）和三磷酸腺苷结合盒转运蛋白（，）的潜在抑制剂，其机制与下调孕烷 受体（，）表达有关。课题组后续 研 究 证 实，在 一 定 浓 度 范 围 内 对 细 胞 具 有 逆 转 作 用，可 影 响 细 胞 内糖 蛋 白（，）的功能和表达，增加 细胞中阿霉素和紫杉醇的化学敏感性，逆转 细胞的多药耐药，并促进细胞凋亡。本研究观察协同仑伐替尼对肿瘤小鼠模型的药效及作用机制。材料 主 要 仪 器十 万 分 子 一 电 子 分 析 天 平（）：德国梅特勒托利多公司；超灵敏多功能 成 像 仪（）：美 国 公司；生物组织包埋机（）：湖北 亚 光；显 微 镜（）：。离 心 机（）：安徽中科中佳科学仪器有限公司；电泳仪（）：北京市六一仪器厂。主要试剂（纯度）由安徽中医药大学 课 题 组 提 供；仑 伐 替 尼（）：公司；抗体（）：江苏亲科生物研究中心有限公司；（）：艾博抗（上海）贸易有限公司；细胞色素 酶（，；）、乳腺癌耐药蛋白（，；）、淋巴细胞 瘤（，；）、相关 蛋白（，；）、（）、（）：武汉三鹰生物技术有限公司；（批号 ）：正宁生物；细胞凋亡检测试剂盒（）：公司。动物雄性 小鼠，体质量 ，购自杭州子源实验动物科技有限公司 生产许可证号 （浙）。所有实验均得到安徽中医药大学动物伦理委员会的批准，动物实验伦理编号为 。小鼠常规喂养，自由饮水，温度（），相对湿度（），暗光周期，适应性饲养周。方法 荷瘤小鼠模型的建立 肝癌细胞在 培养基（含 ，青霉素链霉素）中培养，置于、培养箱中培养，选取对数生长期的细胞进行实验。将细胞密度用 稀释为 ，将所述细胞皮下注射到小鼠右腋，每只小鼠接种 ，当肿瘤体积达到约 时，将小鼠随机分为模型组（生理盐水）、（）组、仑伐替尼（）组、（）仑伐替尼（）组，每组 只。各给药组小鼠连续灌胃周，每日次。给药结束后将小鼠处死，收集血液、心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织。血清样本在下，以 离心 后收集。将部分肝脏和肿瘤组织固定在 福尔马林溶液中进行组织学分析，其余组织立即冷冻在 冰箱以备进一步研究。采用苏木精伊红（，）染色法观察 荷瘤小鼠主要脏器病理变化将小鼠心、肝、脾、肺、肾组织在 甲醛中固定，进行病理检查，乙醇脱水，二甲苯清洗，石蜡包埋，切片和烘干，染色，并在显微镜下观察，以评估和仑伐 替 尼 对 动 物 的 安 全 性。其 余 肿 瘤 组 织 存 放于 冰箱，备用。采用 荧光染色观察 荷瘤小鼠肿瘤组织的凋亡将 荷瘤小鼠肿瘤组织切片放入干燥箱烤片，依次过二甲苯、乙醇，将切片流水冲洗干净，滴加 的蛋白酶，培养箱孵育。冲洗次。滴加 检测液，培养箱孵育。冲洗后封片，数字切片扫描仪扫描荧光切片。法 检 测 、蛋白表达水平称取 荷瘤小鼠的肿瘤组织，加入 裂解液，冰上裂解，离心，收集上清，采用 试剂盒检测蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液，进行 电泳分离，转膜，封闭，加入一抗 、孵育过夜，清洗后二抗孵育 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 ，超灵敏多功能曝光成像仪曝光处理，计算目的蛋白和内参蛋白灰度值之比，实验重复次。统计学方法采用 软件进行统计分析。连续型变量采用“均数标准差（?）”进行统计学描述。多组均数比较，采用单因素方差分析；组间均数多重比较，采用 检验（方差齐时）或 检验（方差不齐时）。组内不同时点体质量比较，采用重复测量数据的方差分析。.表示差异有统计学意义。结果 联合仑伐替尼对移植瘤模型小鼠肿瘤质量及体质量的影响与模型组比较，仑伐替尼组、仑 伐 替 尼 组 小 鼠 肿 瘤 质 量 显 著 降 低（.）；与仑伐替尼组比较，仑伐替尼组小鼠肿 瘤 质 量 显 著 降 低（.）。给 药 前 后组与仑伐替尼组的小鼠体质量无明显变化（.），仑伐替尼组小鼠体质量从第天开始显著降低（.）。结果说明 与仑伐替尼联用可以显著抑制荷瘤小鼠体内的肿瘤生长，且效果优于 单用和仑伐替尼单用。见图。注：模型组；组；仑伐替尼组；仑伐替尼组；与模型组比较，.；与仑伐替尼组比较，.；与给药第天比较，.图各组小鼠肿瘤质量和体质量比较（?，）联合仑伐替尼对移植瘤模型小鼠各脏器的影响与模型组比较，各治疗组小鼠的主要器官（心、肝、脾、肺、肾）均未出现明显病变，提示药物治疗对这些脏器无不良影响；结合 仑伐替尼组小鼠体质量显著下降，而其余各组小鼠体质量无明显变化，可以认为，（）仑伐替尼（）组的给药剂量比较安全。见图。联合仑伐替尼对移植瘤模型小鼠肿瘤组织细胞凋亡的影响与模型组比较，各给药组均发生了明显的细胞凋亡；仑伐替尼组细胞凋亡较仑伐替尼组更加明显。结果提示 联合仑伐替尼增加小鼠异位移植瘤组织的细胞凋亡。见图。联合仑伐替尼对移植瘤小鼠模型组织中 、蛋白表达水平的影响与 模 型 组比较，组 、蛋白表达水平显著降低（.）；仑伐替尼组 蛋白表达水平显著降低（.），、蛋白表达水平显著上升（.）；仑伐替尼组 、蛋白表达水平显著降低（.），、蛋白表达水平显著上升（.）。与仑伐替尼组比较，仑伐替尼组 、蛋白表达水平显著降低（.），蛋白表达水平显著上升（.）。结果说明与仑伐替尼联用抑制了肿瘤组织内核受体 及下游代谢酶和转运体的表达，增加仑伐替尼在肿瘤组织中的蓄积，提高药效，并且调控相关凋亡蛋白，诱导肿瘤组织的细胞凋亡。见图。讨论 是世界范围内常见的一种癌症，是一种高度血管化的肿瘤。的监测、诊断和管理取得了较大的进步，尽管该疾病的发病率在下降，但疾病的特定死亡率仍然很高。是来源于中药藤黄的主要活性成分，药理学研究表明，抗肿 瘤 活 性 强、抗 癌 谱 广。仑 伐 替 尼 主 要 由 代谢，并作为 结合盒（）转运蛋白的底物，如 和 ，分别由 和 基因编码 。、和多药耐药相关蛋白也可能在仑伐替尼药物代谢动力学中发挥作用。是核受体超家族的典型成员，可以被内源性和外源性物质激活。不仅在正常组织中表达，而且在多种类型的人类癌症中表达，包括骨肉瘤、结肠癌 等。最重要的是，在肿瘤组织中的表达水平通常高于非肿瘤组织。新的研究 还表明，参与细胞凋亡、细胞周期阻滞、细胞增殖、血管生成和氧化应激等过程，这些过程与癌症密切相关。有研究 报道，参与糖脂代谢、类固醇激素稳态、胆汁酸代谢等，可通过调控代谢酶（如 ）和转运体（如）的表达，来消除异 ：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 图组小鼠心、肝、脾、肺、肾的组织形态（染色，倍）注：绿染的细胞即为发生凋亡的细胞图组小鼠肿瘤组织细胞凋亡情况比较（染色，倍）：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 注：模型组；组；仑伐替尼组；仑伐替尼组；与模型组比较，.；与仑伐替尼组比较，.图组小鼠肿瘤组织中 、和 蛋白表达水平比较（?，）源生物质和内毒素可能对机体造成的损伤。目前，尚未有研究阐明核受体与耐药现象之间的关系。本研究旨在探讨通过调控 增强 对仑伐替尼的敏感性，诠释协同治疗 的优势和机制，为仑伐替尼的联合用药提供科学依据。研究表明，与肿瘤细胞的凋亡有关，并且可能是 多 药 耐 药 的 重 要 因 素。年，等 证明了在人和大鼠肝细胞中，表达对于 和 上调是必需的。可能通过同时调节解毒和细胞凋亡途径来保护肝脏免受有害化学物质的侵害。等 研究表明，酮康唑和异硫氰酸苯乙酯通过抑制 调控的不同途径增强了铂类化合物的抗肿瘤活性。本研究中 与仑伐替尼联用后，促凋亡蛋白 、表达水平升高，抑凋亡蛋白 表达水平降低，从而诱导了肿瘤组织细胞的凋亡，并且这与已报道的对 癌 细 胞 中 凋 亡 相 关 蛋 白 的 作 用 基 本 相符。本 研 究 中 动 物 给 药 剂 量 选 定 为 与仑伐替尼联用 ，是因为研究结果表明 有抑瘤趋势，且毒性较小，排除了毒性对实验结果的影响；仑伐替尼剂量按照临床上用量及人与小鼠体表面积换算常数得到，然而 仑伐替尼临床用量几乎无抑瘤作用，因此在本研究中增加给药剂量，以 仑伐替尼进行后续实验 。本研究结果表明，联合仑伐替尼对异位移植肿瘤小鼠 增殖具有抑制作用，作用强于仑伐替尼单用。和仑伐替尼联用的小鼠肿瘤组织中，细胞凋亡率高于仑伐替尼组。进一步的机制研究发现，与仑伐替尼联用的小鼠肿瘤组织内核受体 及下游代谢酶和转运体的表达均被抑制，表明其可能通过减少仑伐替尼在肿瘤细胞内的代谢，增加仑伐替尼的蓄积，从而提高药效。联合仑伐替尼可以使肿瘤组织中促凋亡蛋白表达水平上调，抑凋亡蛋白表达水平下调，从而诱导肿瘤细胞的凋亡进程。综上所述，与仑伐替尼联用较仑伐替尼单用更能抑制小鼠肿瘤的生长，两药联用可达到协同增效的作用，该作用与调控 ，下调代谢酶和转运体的表达水平以及调节相关凋亡蛋白的表达水平有关。参考文献：，（）：，：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 ，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，：，（）：，（）：，（）：，：孔祥图，于慧，陈晓丽，等 消癌解毒方联合 样方案治疗弥漫大细胞淋巴瘤临床观察 安徽中医药大学学报，（）：高俊，程卉，李庆林新藤黄酸通过 信号通路干预人脐静脉内皮细胞血管生成的研究 安徽中医药大学学报，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，：，（），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 ，（）：，（）：，（）：，：，：尹孝莉新藤黄酸纳米乳的制备、表征以及初步药动药效学研究 合肥：安徽中医药大学，程卉，彭代银，王效山，等 新藤黄酸体内外抗肿瘤作用研究 中草药，（）：董德操 增加仑伐替尼在肝癌移植瘤动物模型治疗中敏感性的初步探究 北京：北京协和医学院，（）：，（）：（收稿日期：），（，；，；，；，；，；，）（）（），（），（），（），（）（），；（），（），（），（），（），（），（.）（.），（，），（.），（.），；：安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月