新型宏基因组_宏转录组学技术在反向病原学研究中的应用_王亚丽.pdf

*技术与方法*新型宏基因组/宏转录组学技术在反向病原学研究中的应用王亚丽1，麻锦敏1，陈路2，邹弈君3，江佳富4，陈唯军1,3摘要：以微生物组学和宏基因组学为基础的新技术的飞跃式发展为新微生物的发现提供了无可比拟的优势。反向病原学理念公开提出后，在指导新发突发传染病的主动防控实践方面也正在发挥越来越多的作用，在公共卫生和疾病防控领域应用越来越广。新型宏基因组/宏转录组学技术进一步支撑和促进反向病原学研究，在发展评估新微生物致病潜力的理论、策略和方法方面有了一定的进展。在此，本综述梳理了新型宏基因组/宏转录组学技术在反向病原学研究中的作用实践、以及面临的挑战，期望促进人们对病原体的认识和理论技术创新。关键词：新型宏基因组/宏转录组学技术；反向病原学；未来传染病；新发传染病中图分类号:R211;R183.5文献标志码:A文章编号:10039961（2023）05058105Applicationofnovelmetagenomics/metatranscriptomicstechnologiesinreverseetiologyresearchWang Yali1,MaJinmin1,Chen Lu2,Zou Yijun3,Jiang Jiafu4,Chen Weijun1,3.1.BGI PathoGenesis Pharmaceutical Technology,BGI-Shenzhen,Shenzhen 518085,Guangdong,China;2.Beijing Macro&micro-test Bio-Tech Co.,Ltd.,Beijing 101300,China;3.College ofLife Sciences,University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China;4.State Key Laboratory of Pathogens andBiosecurity,Academy of Military Medical Sciences,Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology,Beijing 100071,ChinaCorresponding authorCorresponding author:Chen Weijun,Email:Abstract:Therapiddevelopmentofnewtechnologiesbasedonmicrobiomesandmetagenomicsprovidesunparalleledadvantagesinthediscoveryofnovelmicroorganisms.Sincethepublicationofconceptofreverseetiology,ithasplayedanincreasinglyimportantroleinguidingtheactivepreventionandcontrolpracticeofemerginginfectiousdiseasesandhasbeenwidelyusedinthefieldsofpublichealthanddiseasepreventionandcontrol.Newmetagenomics/metatranscriptomicstechnologieshavefurthersupportedandfacilitatedreverseetiologyresearch,andsomeprogresseshavebeenmadeinthedevelopmentoftheories,strategiesandmethodologiesforassessingthepathogenicpotentialsofnovelmicroorganisms.Thispapersummarizestherole,applicationofnewmetagenomics/metatranscriptomicstechnologiesinreverseetilogyresearchandthechallengesinitsapplicationforthepurposeofimprovingtheunderstandingofpathogensandtheoreticalandtechnicalinnovations.Keywords:Novelmetagenomics/metatranscriptomicstechnologies;Reverseetiology;Futureinfectiousdisease;EmerginginfectiousdiseaseThisstudywassupportedbythefundforNationalKeyResearchandDevelopmentProgramofChina(No.2019YFC1200500,No.2019YFC1200501)近 30 年全球出现了多种新发突发传染病，如非典型性肺炎、高致病性禽流感、中东呼吸综合征等，给人类健康、社会经济和稳定带来了严重影响。虫媒携带微生物传播的疾病占全部传染病的17%以上，对人的健康构成严重威胁，然而自然界尚有超过 99%的微生物不为人类所知。随着新型高通量宏基因组/宏转录组学技术（metagenomicnext-generationsequencing，mNGS）的广泛应用，越来越多的新微生物被发现并报道15。其中，很多新微生物都是通过从宿主媒介发现，后确认人类致病性的系列新病原体，尤其是基于以基因序列为基础的微生物分类新技术体系结合后续流行病学、病原学依据发现新病原的路径，与传统病原体发现存在很大基金项目：国家重点研发计划项目（No.2019YFC1200500，No.2019YFC1200501）作者单位：1.深圳华大因源医药科技有限公司,广东深圳518085；2.北京宏微特斯生物科技有限公司,北京101300；3.中国科学院大学生命科学学院,北京100049；4.军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室,北京100071作者简介：王亚丽，女，江苏省泰州市人，博士，主要从事宏基因组学病原检测技术工作，Email：通信作者：陈唯军，Tel：075536382041，Email：收稿日期：20221027网络出版日期：20230508疾病监测2023年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,2023,Vol.38,No.5581www.jbjc.orgDOI:10.3784/jbjc.202210270462区别。徐建国院士在 2019 年提出了反向病原学的新理念，在该理论和理念的指导下，mNGS 技术进一步发挥在新病原发现与确认研究，主动防控未来传染病的实践方面的作用。1mNGS 技术的介绍mNGS 通过对临床样本的 DNA 或 RNA 进行鸟枪法测序，可以无偏倚地检测多种病原微生物，按从临床样本中提取的核酸类型可以分为宏基因组测序和宏转录组测序。该技术直接对样本中所有核酸进行无偏性测序，结合病原微生物数据库及特定算法，检测样本中含有的可能病原微生物序列，该技术的社会经济成本不断降低和技术的不断完善，已逐渐从科研走向临床应用，成为临床疑难和未知病原微生物检验的重要手段。mNGS 技术给病原识别鉴定带来了新的方法和思路，具有检测周期短（1d），检测范围广，结果丰富（菌种鉴定、耐药检测）等优势。该技术不需要先行假设是某（几）种或某（几）类可能的病原体并一一特定的对病原进行靶向检测，而是直接对不同类型样本进行测序，并结合特异的病原核酸数据库，通过序列比对、变异进化分析等生物信息学方法，识别可能的致病性病原和发现新发病原，为临床诊治提供指导；在获得足够丰度的序列条件下，还可以对病原分型、耐药分析；对于新发病原，可以开展溯源、进化分析，追溯病原来源，最终实现新突发传染病病原的快速识别、对疫情暴发进行预测预警6。但作为一项新兴技术，mNGS 技术仍有一些局限性需要进一步发展：受测序成本及临床可负担性、数据库等影响，临床 mNGS 策略较低的测序覆盖度并不足以获得样本中所有微生物的序列，尤其是高浓度宿主背景的样本，临床标本中低浓度致病微生物可能会漏检；对于需要更高覆盖度的特定耐药或毒力基因的分析，亦只对高浓度样本才能实现。另外，理论上宏基因组可以应用于任何样本，但样本中不同微生物与宿主含量组成差异及不同微生物类别自身结构差异等，会导致不同的样本处理、核酸提取制备方式及是否执行 RNA 测序流程等都可能会导致结果偏差。2反向病原学的提出与内涵反向病原学的理念最早由中国微生物学会理事长、中国工程院徐建国院士于 2019 年正式提出的7。我国科学家在野生动物源性和虫媒自然源性疾病领域一些前瞻性科学发现和成功案例之基础上，结合部分新发传染病发现过程中不完全依赖科赫法则而提出。如 2015 年啮齿动物中发现的新型沙粒病毒温州病毒8，随后在东南亚发现温州病毒感染患者9；其内涵包括：（1）发现、分离、命名新的微生物。（2）评估新发现微生物的潜在致病性或者公共卫生意义。（3）提出未来可能引起新发突发传染病疫情的新发现的微生物目录。（4）研究检测、诊断、治疗、预防控制的技术、方法、措施、策略等。（5）预防发生或早期扑灭疫情，确保不发生重大新发突发传染病疫情。开展反向病原学研究，可变被动为主动，预防发生重大传染病疫情7。3新型 mNGS 技术对于反向病原学的支撑基于测序技术衍生出来的 mNGS 检测技术，通过对临床样本 DNA 或 RNA 进行随机测序，结合病原微生物数据库及特定算法，无偏倚地检测样本中含有的可能病毒、细菌、真菌、寄生虫及非经典微生物的序列，成为临床疑难和未知病原微生物检验的重要手段，是目前快速检测不明原因感染、罕见病以及发现新病原体的重要手段3，10。3.1mNGS 在发现罕见和难培养已知病原体面的应用目前 mNGS 技术已被广泛的应用于中枢、呼吸道、败血症感染的病原微生物诊断中。Wilson 等112014 年报道，采用 mNGS 技术，在 1 例经各种常规检查均无法明确病因的 14 岁患重症联合免疫缺陷并发脑膜炎的男孩脑脊液中检测到钩端螺旋体序列，后改用青霉素治疗获得痊愈，成为 mNGS 确诊钩端螺旋体病引起的不明脑炎的首例临床应用案例。此后采用 mNGS 技术相继在恶性血液病和造血干细胞移植后患者脑脊液或血液中检出罕见致病菌感染，如痤疮丙酸杆菌脑膜炎、溶血梭状芽孢杆菌败血症和星状病毒感染10，1213。在 24 例骨关节感染患者中，同时采用 mNGS 技术和传统微生物培养寻找病原微生物，mNGS 技术检出了 273 株培养法未检出的细菌，其中 182 株评估为可能致病菌14。应用脑脊液二代测序确诊疱疹病毒性脑炎和李斯特菌脑膜炎病例，将中枢神经系统感染性疾病的病原体诊断率提高了 25%40%15。2018 年 Wang 等16基于 mNGS 确定一例 42 岁深度昏迷、颅内压增高、脑脊液生化指标异常但脑脊液细菌培养阴性的男性患者感染福氏纳格里阿米巴原虫，成为我国首次报告原发性阿米巴脑膜炎的病例。同年，从一个由伪狂犬病病毒感染引起的人眼内炎手术眼睛玻璃体液中，利用 mNGS 测出 4832 条猪疱疹病毒序列，首次在基因学水平和免疫学水平同时鉴定猪疱疹病毒跨物种感染人病例的存在17。而针对 2019 年在圭亚那从事锰矿开采的中国员工出现聚集性不明原因发582疾病监测2023年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,2023,Vol.38,No.5www.jbjc.orgDOI:10.3784/jbjc.202210270462热疾病，基于 mNGS 在标本中发现荚膜组织胞浆菌序列，结合流行病学史和临床表现以及 X 线胸片检查等结果，确认了本次突发不明原因聚集疫情的真凶18。这些研究均显示了 mNGS 技术对传统微生物培养无法检测到的病原菌、罕见病原菌发现与鉴定具有独特的优势。3.2mNGS 在不明原因患者新病原体发现方面的应用基于 mNGS 技术在发现新发病原体已起到了关键性的作用。如新型沙粒病毒、蜱传新布尼亚病毒、艾比湖病毒和狼牙病毒等。2008 年 Palacios 等3从患者脑脊液、血液、肾脏、肝脏等样本，通过宏基因组学测序发现一种新型沙粒病毒，随后开展分离培养和血清学检测，证实了感染致病结果。针对河南等地不断报道的不明原因发热伴血小板减少综合征疫情，2010 年河南省疾病预防控制中心与华大基因的研究者采用了一种有别于国际上传统发现新病毒的新型技术路线，即先利用 mNGS 技术首先发现新的布尼亚病毒基因片段，并建立分子生物学检测方法筛查阳性标本，再指导病毒分离，最后从免疫学、流行病学和临床特点等方面，证明了该新布尼亚病毒与疾病的致病关系4。2014 年研究人员通过对新疆维吾尔自治区艾比湖地区的蚊媒样本开展宏转录组测序，发现可能存在一种与 Germistonvirus 最近源的新布尼亚病毒（艾比湖病毒，EbinurLakevirus），进一步分离培养获得了该病毒，并在人群和动物血清中可以检测到该病毒抗体，表明该病毒对人或动物具有潜在的致病风险1920。2021 年我国研究人员通过对媒介生物的监测，采用 mNGS 技术从一种啮齿动物体内发现可能存在一种新的亨尼帕病毒，进一步结合靶向捕获测序获得了新病毒的基因组序列，通过对不明发热患者开展回顾性特异PCR 筛查、基因组测序及分离培养，证实了该新病毒的存在与致病关系，命名为狼牙病毒（Langyahenipavirus，LayV）21。这些新发病原的快速发现，mNGS 发挥了不可替代的作用，是新发突发传染病研究的一种强大工具。3.3mNGS 在动物源性新病原体前瞻性主动发现方面的应用mNGS 技术极大促进了病原微生物的检测以及未知病原的发现，但是目前应对传染病的现行策略基本上是被动的。基于反向病原学的理论基础，变被动为主动，开展动物源性新病原体的前瞻性筛查和技术储备，是预防发生重大传染病疫情的先手棋6。此前的几个经典案例，温州病毒病78、新山羊无形体病22和荆门蜱传病毒感染2324等，均是非常好的应用。针对野生动物和虫媒来源的新型微生物病原体的发现和确认，mNGS 具有无可比拟的优势。2016 年从我国青藏高原野生动物发现、分离和命名的 20 种左右新的细菌，其中青海省旱獭中分离到的埃希菌新种，在当时被预测具有致病潜力25，2022 年在挪威的 4 例患者中，首次被确认为致病菌，并推测可能是一种相对常见的人类病原体26。从脊椎动物宿主和无脊椎动物媒介中发现和命名的2000 多种新病毒5，27，其中已经有后来被证明是具有致病性的24。选择携带病毒种类多的哺乳动物蝙蝠，数量多、分布广的蚊虫等作为主要研究对象，选择有生态学、流行病学代表意义的地域，大量采集标本，将传统病原体分离技术和现代高通量分子生物学技术相结合，对这些野生动物和媒介昆虫携带的微生物和病原体、分布特点、遗传进化规律及其对人类的致病性研究，可预警未来新发传染病的暴发。美国十年前启动的全球病毒组计划等也都是很好的借鉴。3.4mNGS 技术发现新微生物及微生物潜在致病性评估技术和理论的发展基于 mNGS 的研究给新微生物识别鉴定带来了新的方法和思路，该方法被广泛应用于病毒组研究中，如 Shi 等5基于宏基因组/宏转录组技术对环境样品的调查揭示了生物圈中存在着丰富的病毒种类。虽然无法直接获得经典的病毒表型特征及对人类的致病性，但该方法有助于快速构建全球性的病毒多样性数据库。在应对新发突发传染病时，如何快速识别致病病原体是首要问题，而 mNGS 技术的发展则推动了新发突发传染病病原体快速发现策略，主要体现在对以下三种能力的提升：（1）定植、感染微生物的区分。人体各个部位都存在大量的微生物，在人体部位生长繁殖而对人体不造成危害的微生物称为定植微生物。正常情况下体内的菌群处于一个动态的平衡状态，当这种平衡被外界因素打破时菌群中的某种细菌可能成为致病菌，这一类细菌称为机会致病菌，也可称为条件致病菌。当确定条件致病菌为病原体时应该考虑患者的免疫状态、基础疾病及感染部位。通过 mNGS 技术，可以尝试寻找宿主或微生物的差异表达基因或位置迁移的定量变化，结合这些生物标记构建鉴别微生物感染（条件致病）与定植模型。（2）罕见及非典型疾病病原体快速诊断。mNGS 技术的发展应用，能够快速对待测样本的总核酸进行测序分析，通过与人类已知病原数据库的比对，对待测样本中可能存在的病毒、细菌、真菌、寄生虫等病原体进行检测分析，尤其在不明原因的临床感染样本中对罕见及非典型疾病病原体发掘具有巨大优势。（3）新发病原体的快速发现与预警。结合微生物系统进化理论与新病原预警软件开发，能够快速发现潜在的新致病疾病监测2023年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,2023,Vol.38,No.5583www.jbjc.orgDOI:10.3784/jbjc.202210270462微生物。通过对测序序列与数据库的比对分析，按照比对到某种已知微生物的最高相似度值的大小，区分为潜在新种与原物种。进一步基于同源物种的致病性、侵袭因子、毒力基因、耐药基因等数据分析，预警是否为潜在新病原。4新型 mNGS 技术在反向病原学中的应用发展方向以及面临的挑战和问题现如今，mNGS 已广泛用于病原检测并做了相关生物信息学分析。分析获得野生动物、规模化养殖动物、无脊椎动物和宠物样本中微生物群落结构，发现新的细菌种类，获得多种动物样本的病原谱，发现可能的致病菌和潜在传染源。有助于建立基于宏基因组的针对胞内细菌分类鉴定的技术体系，研究环境及媒介中潜在病原体的存在，揭示潜在的传播风险和传播特征。利用临床队列和动物感染模型，系统精准地绘制宿主免疫相关细胞或关键因子的图谱，解析重大感染性疾病病原（如艾滋病病毒、乙型肝炎病毒等）持续性感染和再激活的分子机制，并有针对性地设计药物及免疫干预手段。相同策略的宏基因组研究方法也可监测媒介生物，评估病原体感染人类的可能性，预防人畜共患病发生。mNGS 可助力提高临床新发病原诊断能力与抗生素合理使用水平，完善国家传染病防治科技支撑体系，提升突发急性传染病应对能力。通过宏基因组标准化检测平台与大数据通道，连接临床感染诊断和疫情传染防控系统，提升我国传染病诊断防控能力。另外，通过宏转录组测序技术，结合宿主转录谱及微生态环境，尝试寻找宿主或病原的差异表达基因，结合这些生物标记构建鉴别病原体感染与定植模型，辅助临床精准诊断。如何利用好 mNGS 工具支撑反向病原学在未来还需要不断探索，尚存在一些技术和理论问题。（1）基于 mNGS 技术发展新型病原体发现、鉴别及其致病性评估与确认等技术和新理论。联合基因组学和生物信息学，提高测序技术发现新型微生物的敏感性与特异性，有效开展新型微生物与病原数据库的比较，发现已知侵袭因子、毒力基因、耐药性基因等，进行潜在致病性预测方面有待创新发展。（2）基于 mNGS 技术拓展重要动物和媒介、特定环境中反向病原学研究。基于 mNGS，从源头入手，研究其携带或贮存的病原、分布特点、遗传进化规律及其对人类致病性及其对人类的风险大小；从宿主和病原相互作用角度，研究跨种溢出传播机制，开展阻断病原向人类社会溢出的研究。（3）基于 mNGS 技术开展人群潜在感染性和致病性分析。即建立和检索人或动物标本的基因序列数据库，探索新发现的微生物是否已经感染了人类；建立基于个性化的病原体基因、蛋白质序列数据库和生物信息学、人工智能新算法、新技术和新理论分析预测潜在致病性等。5展望反向病原学理论提出以来，大大推动了野生动物和虫媒微生物前瞻性主动发现与确认，正在逐步改变传染病被动应对的局面。尤其针对新发突发重大疫情，变被动应对为主动，提前布局未来病原组前瞻调查研究计划成为业界共识。比如，系统开展野生动物、虫媒、迁徙动物等病媒生物反向病原学研究计划，开展极地、冰川、高原、海洋、地下洞穴等极端环境以及陆地边境线、“一带一路”倡议沿线等特殊环境未来病原组研究计划，发现、确认并掌握潜在病原体的流行风险，主动预防和防御未来新发传染病。此外，反向病原学原理在昆虫传播的植物病害领域也有广泛的发展，比如，开展危害传播水稻、棉花与枣树等重要主粮作物和经济作物的虫媒携带微生物的研究，可以为粮食安全的主动保障发挥重要作用。mNGS 是一个非常高效的新微生物发现工具，结合反向病原学理念直接运用该技术应对新发突发传染病疫情，为未知病原的检测及发现提供有效的技术平台，能够快速发现、预警新发突发疫情的病原真凶，成功打开了宏基因组学在公共卫生和疾病防控领域的应用大门。在利用 mNGS 工具应对新发突发传染病的实践中，基于序列的微生物发现与致病相关的确认将不断完善，也将不断促进人们对病原体的认识和理论技术的创新。利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突参考文献QinJJ,LiRQ,RaesJ,etal.Ahumangutmicrobialgenecatalogueestablished by metagenomic 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