DB2308T 182-2023稻瘟病菌无毒基因检测PCR法技术规范.pdf

DB2308/T182-2023前言本文件按照GBT1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由黑龙江省佳木斯市农业农村局提出并归口。本文件由黑龙江省佳木斯市市场监督管理局批准发布。本文件起草单位：黑龙江省农业科学院水稻研究所。本文件主要起草人：陆文静、周通、王桂玲、周雪松、韩笑。本文件2023年首次发布。DB2308/T182-20233.5 Goldenview:核酸染料，替代溴化乙锭。3.6 DNA Marker:标准分子量的核酸标记。4原理提取稻瘟病菌菌丝DNA，根据无毒基因保守区域序列设计特异性引物，对样品进行PCR扩增，根据序列比对结果，依据是否扩增得到预期的DNA片段大小的序列来判断样品是否携带该无毒基因。5仪器设备电子天平、瓷质研钵、研杵、移液枪、水浴锅、高速离心机、核酸浓度测定仪(NanoDrop2000)、基因扩增仪、琼脂糖电泳槽及电泳仪、凝胶成像系统，其它相关仪器设备。6试剂及样品干燥的稻瘟病菌丝0.05g0.1g、10%CTAB、5 M NaCl、0.5 M EDTA(pH8.0)、1 M Tris(pH8.0)、1TE缓冲液、氯仿：异戊醇(24：1)、75%乙醇、Goldenview等。除非另有说明，仅使用分析纯试剂和ddH20或符合GB/T6682规定的一级水。7实验过程防污染措施检测过程中防止污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行。8实验步骤8.1稻瘟病菌菌丝DNA提取取单孢培养后烘干的菌丝0.1g于研钵中加入液氮用研杵研磨，菌粉转入2L灭菌离心管，并加入65预热的DNA提取缓冲液700L,盖盖混匀，置于水浴锅内65温浴1h(期间间隔15min摇动混匀，使DNA提取缓冲液与菌丝充分混合，保证菌丝DNA的提取效率)。I20O0rmin离心10min,取上清液600L置于新的2mL离心管，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)振荡抽提5min10min,l2000rmin离心10min。缓慢吸取上清液500L置于新的1.5mL离心管，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)振荡抽提5min10min,12000rmin离心10min。缓慢吸取上清液300L于新的1.5mL离心管，加入900L、-20预冷的无水乙醇，-20放置10min,12000r/min离心10min。2