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欢迎关注本刊公众号肿瘤影像学肿瘤影像学2023年第32卷第5期Oncoradiology 2023 Vol.32 No.5445论著基金项目：国家自然科学基金（21771041）通信作者：王明伟E-mail:68Ga标记四嗪探针68Ga-NOTA-Tz的制备与体内外性质评价 张丰盛1，2，王撵1，2，宋少莉1，3，4，杨红2，王明伟1，3，41.复旦大学附属肿瘤医院核医学科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海200032；2.上海师范大学化学与材料科学学院，上海200234；3.复旦大学生物医学影像研究中心，上海200032；4.上海分子影像探针工程技术研究中心，上海200032摘要目的：探索一种68Ga标记四嗪探针（68Ga-NOTA-Tz）的优化标记条件，并评价其体内外性质。方法：开展68Ga-NOTA-Tz的标记条件优化实验，包括反应体系的pH值、温度、时间和前体用量等4种影响因素。利用放射性快速薄层色谱（Radio-iTLC）和放射性高效液相色谱（Radio-HPLC）测定68Ga-NOTA-Tz的标记率和体外稳定性，并进行脂水分配系数log P、血浆蛋白结合率、BALB/c正常鼠血液半衰期和生物分布、以及在SMMC-7721移植瘤模型MicroPET/CT显像等体内外性质评价。结果：根据优化实验结果，68Ga-NOTA-Tz最佳标记条件是反应体系pH=3.8、反应温度45、反应时间 10 min、前体用量5 nmol，在此条件下其标记率大于95%。体外实验显示，68Ga-NOTA-Tz在生理盐水和胎牛血清中的稳定性分别保持在95%和90%以上（4 h内），其脂水分配系数log P为-2.060.02，血浆蛋白结合率为20%左右（1.5 h内）。血液半衰期实验表明，68Ga-NOTA-Tz的早期快速分布半衰期为1.1 min、终末缓慢清除半衰期为29.1 min。体内生物分布和肿瘤MicroPET/CT发现，68Ga-NOTA-Tz主要分布于肝、胆、肾脏和膀胱等代谢器官，对应的%ID/g均较高，同时在肿瘤组织均匀分布，0.5、1.0、1.5 h时的%ID/gmean分别为1.60.11、1.30.15和1.30.12，与肌肉和心脏的较为接近。结论：本研究优化建立了四嗪探针68Ga-NOTA-Tz的制备条件，其标记率高，具有良好的稳定性和亲水性，在体内能快速而均匀地分布至肿瘤组织，有利于其应用于基于体内生物正交点击反应的肿瘤预靶向PET/CT显像。关键词核素68Ga；放射性标记；四嗪探针；正电子发射体层成像/计算机体层成像；肿瘤中图分类号：R445.6 文献标志码：ADOI:10.19732/ki.2096-6210.2023.05.008Preparation and in vitro/in vivo property evaluations of 68Ga-radiolabeled tetrazine probe 68Ga-NOTA-Tz ZHANG Fengsheng1,2,WANG Nian1,2,SONG Shaoli1,3,4,YANG Hong2,WANG Mingwei1,3,4(1.Department of Nuclear Medicine,Fudan University Shanghai Cancer Center,Department of Oncology,Shanghai Medical College,Fudan University,Shanghai 200032,China;2.College of Chemistry and Materials Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China;3.Center for Biomedical Imaging,Fudan University,Shanghai 200032,China;4.Shanghai Engineering Research Center of Molecular Imaging Probes,Shanghai 200032,China)Correspondence to:WANG MingweiE-mail:Abstract Objective:To explore the optimal radiolabeling conditions of 68Ga-labeled tetrazine probe(68Ga-NOTA-Tz),and to evaluate it s in vitro and in vivo properties.Methods:The optimization experiments of the radiolabeling conditions of 68Ga-NOTA-Tz were carried out,including 4 influencing factors such as pH,temperature,time and precursor amount.The radiolabeling efficiency and in vitro stability of 68Ga-NOTA-Tz were determined by Radio-iTLC and Radio-HPLC and its lipid-water partition coefficient log P,plasma protein binding ratio,blood half-life and biodistribution in normal BALB/c mice,as well as MicroPET/CT imaging in SMMC-7721 xenograft tumor mouse model were evaluated.Results:According to the results of optimization experiments,the optimized radiolabeling conditions of 68Ga-NOTA-Tz were pH=3.8,temperature at 45,reaction time of 10 min,and precursor amount of 5.0 nmol and the radiolabeling efficiency under these conditions was above 95%.In vitro assays showed the stability of 446张丰盛，等 68Ga标记四嗪探针68Ga-NOTA-Tz的制备与体内外性质评价 近年来，因为具有优异的选择性和生物正交性、快速的逆电子需求狄尔斯-阿尔德（inverse electron demand Diels-Alder，IEDDA）反应，四嗪（Tetrazine，Tz）/反式环辛烯（trans-cyclooctene，TCO）体系在肿瘤预靶向正电子发射体层成像（positron emission tomography，PET）/计算机体层成像（computed tomography，CT）领域的应用备受关注1。研究2-3表明，放射性核素标记Tz探针和TCO修饰抗体的组合体系表现出良好的肿瘤预靶向核素显像效果。在该体系中，核素标记的小分子Tz衍生物发挥探针的作用，是实现肿瘤预靶向核素显像的关键因素之一。为了开展肿瘤预靶向PET/CT或单光子发射计算机体层成像（single-photon emission computed tomography，SPECT）/CT研究，目前已经报道了不同核素标记的Tz探针，例如从111In（t1/2=2.83 d）标记双吡啶Tz衍生物开始4，逐渐发展了99mTc（t1/2=6.02 h）5、89Zr（t1/2=78.4 h）6、64Cu（t1/2=12.7 h）7、18F（t1/2=109.8 min）8-9和68Ga（t1/2=68.1 min）10等核素标记的Tz探针。其中，111In和99mTc适用于SPECT，图像分辨率较低。其他几种用于PET/CT的正电子核素中，89Zr和64Cu的半衰期较长，存在辐射剂量较大、固体靶生产成本较高、可及性较低等局限性。18F是目前使用广泛的核素之一，具有较为合适的半衰期、经济的生产成本和可及性强等优势，然而通常的18F标记温度均较高，在标记过程中可能容易破坏Tz结构而使其失去活性9，11。比较而言，68Ga是近几年应用日益增加的金属核素，其半衰期短，辐射剂量较低，由68Ge/68Ga发生器淋洗而得，较易获取，成本较低，灵活性大，并且采用螯合方式标记68Ga，反应条件温和，标记率高12-13。因此，68Ga标记Tz探针是引人关注的核素标记Tz衍生物之一，在基于Tz/TCO体系的肿瘤预靶向显像领域具有很大的发展潜力。为了探索68Ga标记Tz探针在基于Tz/TCO体系的肿瘤预靶向PET/CT应用的可行性，本文选择Tz探针68Ga-NOTA-Tz为对象，开展其放射性标记条件优化和包括稳定性、生物分布和肿瘤MicroPET/CT在内的体内外性质评价研究，为68Ga标记Tz衍生物的体内生物正交点击反应策略的应用提供直观的实验参考。1材料和方法1.1仪器与试剂1.1.1仪器采用德国Siemens公司的Inveon小动物MicroPET/CT机；德国Isotope Technologies Garching公司的68Ge/68Ga发生器；美国Agilent公司的液相色谱仪1260 Infinity，配有可变波长紫外检测器、放射性检测器（德国Raytest公司）和PLRP-S分析柱（5 m，300，250.0 mm 4.6 mm）；挪威Biosan公司的TS-100金属浴振荡器；德国Sigma公司的3-30K冷冻离心机；德国Sartorius公司的BSA124S精密天平；德国Raytest公司的MiniGita Star放射性薄层色谱扫描仪；上海核所日环光电仪器有限公司的SN-6110 放射性免疫计数仪。1.1.2试剂核素68Ga来自于68Ge/68Ga发生器，NOTA-68Ga-NOTA-Tz in saline and fetal bovine serum remained above 95%and 90%within 4.0 h,respectively,its log P was-2.060.02,and the plasma protein binding rate was about 20%within 1.5 h.The blood half-life tests of 68Ga-NOTA-Tz found the early rapid distribution half-life was 1.1 min and the terminal slow clearance half-life was 29.1 min.In vivo biodistribution and tumor MicroPET/CT imaging revealed that 68Ga-NOTA-Tz was mainly distributed in metabolic organs such as liver,gallbladder,kidney and bladder with relatively high%ID/g,and was homogeneously distributed in tumor lesion with%ID/gmean of 1.60.11,1.30.15 and 1.3 0.12 at 0.5,1.0 and 1.5 h,respectively,which were closer to those of muscle and heart.Conclusion:In this stud