5-氨基乙酰丙酸处理对葡萄果实品质及相关基因表达的影响.pdf

南京农业大学学报():/.:./.收稿日期:基金项目:国家重点研发计划项目()作者简介:杨思玲硕士研究生通信作者:房经贵教授主要从事葡萄遗传育种与基因组学、葡萄发育生物学与栽培生理、葡萄高效生产栽培技术的研究:.杨思玲金欢淳张培安等.氨基乙酰丙酸处理对葡萄果实品质及相关基因表达的影响.南京农业大学学报():.():.氨基乙酰丙酸处理对葡萄果实品质及相关基因表达的影响杨思玲金欢淳张培安樊秀彩生弘杰卢素文房经贵(.南京农业大学园艺学院江苏 南京.温州市农业技术推广中心浙江 温州.中国农业科学院郑州果树研究所河南 郑州.江苏省农业科学研究院农产品质量安全与营养研究所江苏 南京)摘要:目目的的 本文旨在探讨 氨基乙酰丙酸()处理对葡萄果实可溶性糖和花色苷含量以及相关基因表达的影响为 在鲜食葡萄生产中应用提供理论依据 方方法法 以 个鲜食葡萄品种为试材在膨大期果实表面喷施 溶液以清水处理为对照测定果实发育过程中外观色泽指数、可溶性固形物、可溶性糖、花色苷含量等生理指标及相关基因表达水平的变化 结结果果 处理能诱导巨玫瑰等大多数葡萄品种提前转色果实色泽指数增加果肉中可溶性固形物和可溶性糖含量显著增加果皮中总花色苷含量以及锦葵色素等花色苷组分含量显著增加 基因表达分析结果显示 处理能促进大多数葡萄品种果肉中酸性转化酶()和中性转化酶()基因表达水平增加抑制蔗糖转运蛋白()和蔗糖磷酸合成酶()基因的表达进而提高葡萄果肉可溶性糖含量并且 处理的不同葡萄品种果皮中查尔酮合酶()、葡萄糖类黄酮葡萄糖转化酶()、无色花青素双加氧酶()等基因表达水平增加进而促进葡萄果皮花色苷积累 结结论论 外源喷施 不仅能促进果肉中糖分积累提高果实内在品质还能促进果皮中花色苷积累改善果实外在品质关键词:葡萄氨基乙酰丙酸果实品质糖分花色苷中图分类号:.文献标志码:文章编号:()(.):().()()()()():()().:南 京 农 业 大 学 学 报第 卷葡萄是世界性重要果树之一其果实味美多汁备受市场欢迎 色泽是衡量葡萄果实外观品质的重要指标可以用于衡量果实成熟度根据果实的不同加工需求确定适宜的采收期 生产实践中通常采用套袋、环剥、铺反光膜、喷施植物生长调节剂等栽培措施来改善果实色泽提高果实外观品质 其中植物生长调节剂因具有微量、高效等优点已被广泛应用于果实生产中 然而研究发现赤霉素、脱落酸等植物生长调节剂虽然能够促进果实着色但也容易导致采前落果不利于果品采后贮藏 随着人们对食品安全问题的日益关注氯吡脲(俗称“膨大剂”)等植物生长调节剂的大量使用引起人们的担忧因此亟需寻找绿色、高效且无副作用的植物生长调节剂来改善果实品质氨基乙酰丙酸()是生物体内天然存在的一种功能性非蛋白质氨基酸是所有卟啉化合物(叶绿素、亚铁血红素、维生素、光敏色素等)生物合成的前体物质 不仅是一种中间代谢产物还被认为是一种天然、无毒、无污染的新型植物生长调节剂被广泛应用于苹果、草莓、无花果等多种果树的生产实践中 研究表明适宜浓度的外源 处理能够调节植物生长发育促进植物光合作用提高农产品质量增强植株抗逆性 例如采用.浸泡水稻幼苗根系可以使其植株干重增加 采用 喷施萝卜叶面可以增产 在苹果成熟前 喷施 可显著促进苹果果皮花色苷的积累外源 处理在葡萄中也有较多研究 例如赵宝龙等研究发现叶面喷施 能够增加葡萄株高和茎粗张梦燕等研究发现外源喷施 能够提高葡萄果皮花色苷、叶绿素、类胡萝卜素和可溶性糖含量刘连玲等研究发现喷施 溶液可以不同程度提高克瑞森无核葡萄果实可溶性固形物和可溶性糖含量张静等研究发现中低浓度(.)可促进刺葡萄愈伤组织生长显著增加刺葡萄愈伤组织的生物量同时提高刺葡萄细胞中黄酮类化合物、原花青素和花色苷浓度另外外源 处理通过影响相关基因的表达进而促进果实中糖和花色苷积累 然而前人研究大多针对单一葡萄品种尚不清楚 处理是否适用于大部分鲜食葡萄品种 本试验通过探究 处理对 个鲜食葡萄品种果实内外品质及相关基因表达的影响旨在为 在葡萄优质化生产中的应用提供理论指导 材料与方法.试验材料供试材料为 个鲜食葡萄品种均采自中国农业科学院郑州果树研究所国家葡萄种质资源圃 各品种特征(来源于中国葡萄志)和采样时期详见表 溶液购自上海麦克林生化科技有限公司表 供试品种信息及采样时期 编号.品种种群成熟期果皮色泽 采样时期(月日)()天使玫瑰香 欧亚种 黄绿色 秀特玫瑰 欧亚种 绿黄色 超宝 欧亚种 黄绿色 安芸皇后 欧美杂种 粉红色 红奥林 欧美杂种 鲜红色 沪培 号 欧美杂种 鲜红色 牡丹红 欧亚种 鲜红色 蓓蕾玫瑰 欧美杂种 紫红色 巨玫瑰 欧美杂种 紫红色 瓶儿 欧亚种 紫红色 摩尔多瓦 欧美杂种 紫黑色 哈佛德 欧美杂 紫黑色 紫鸡心 欧亚种 紫红色 香槟 美洲种 蓝黑色 黑汉 欧亚种 紫黑色 黑玫瑰 欧亚种 紫黑色 注:):):果实膨大期 :果实膨大期 :果实转色初期 :果实转色期 :果实始熟期 :果实成熟期 .第 期杨思玲等:氨基乙酰丙酸处理对葡萄果实品质及相关基因表达的影响.试验处理与样品采集选取每个品种中叶幕环境相似、大小一致、生长良好且无病虫害的果穗分别进行处理 前人研究发现不同浓度 处理对葡萄果皮花色苷含量及糖酸比影响不同其中以 处理效果最好 因此本研究采用 溶液(含.)在果实膨大期和对果穗先后各喷施 次(处理组)以喷施相同量的清水溶液(含.)作为对照()处理后分别于果实膨大期()、果实膨大期()、果实转色初期(的果实已开始转色/软化)、果实转色期(的果实已开始转色/软化)、果实始熟期(果实完成转色)和果实成熟期(果实可溶性固形物、可滴定酸含量趋于稳定种子变褐)采集处理组和对照组果实样品 将果皮和果肉分别用液氮速冻贮存于 超低温冰箱备用.红葡萄色泽指数()的测定使用 色差计()测定果实 个点(腹部、背部、个侧面)的色泽 其中表示颜色的亮度、表示颜色组分利用 和 值可以计算色调角()和色泽饱和度()/()/为综合颜色指标从 至 依次表现为紫红、红、橙、黄、黄绿、绿、蓝绿色()/().总可溶性固形物和可溶性糖含量测定使用手持折光仪随机测定(日本)个单果粒可溶性固形物含量取平均值 可溶性糖含量测定:准确称取.果肉用液氮研磨成粉末加入.(体积分数)乙醇 水浴 离心 取上清液沉淀用上述步骤重复提取 次合并上清液定容至 低温冷冻干燥后加入 超纯水溶解采用微孔滤膜(.)过滤 采用高效液相色谱()检测提取液中可溶性糖含量 色谱条件:采用安捷伦色谱仪 柱(.)检测器柱温 流动相为乙腈和水(体积比为 )进样量 流速为.蒸发光散射检测器参数:载气为氮气气体流量.漂移管温度 采用面积外标法处理数据采用 等的方法分析可溶性糖含量每个处理重复测定 次.总花色苷、花色苷组分及含量测定采用 等的方法测定葡萄果皮总花色苷含量 利用液相色谱质谱联用()系统()测定花色苷组分和含量 色谱条件:柱(.柱含.颗粒)流速为.缓冲液 为.甲酸水溶液缓冲液 为.甲酸乙腈溶液流动相程序:缓冲液 使用具有 采集模式的正离子和负离子模式的电喷雾源进行质谱分析所选范围为 /使用 启用锁定质量选项以进行重新校准 电离参数如下:毛细管电压为.碰撞能量为 源温度为 去溶剂化气体温度为 以大豆苷元作为内标进行花色苷组分相对含量分析 每处理重复 次对测定结果取平均值 使用 .软件进行数据采集和处理.提取、合成和实时荧光定量()采用 法提取果实样品总 采用 反转录试剂盒(上海翊圣生物)合成 参照试剂盒说明进行 反应以 为内参采用 方法计算目的基因的相对表达水平 基因登录号及定量引物见表 表 定量引物 种类基因名称 登录号.引物序列()花色苷合成相关基因 ./南 京 农 业 大 学 学 报第 卷续表 种类基因名称 登录号.引物序列()糖代谢相关基因 ./注:查尔酮合酶基因 :查尔酮异构酶基因 :黄烷酮羟化酶基因 :葡萄糖类黄酮葡萄糖转化酶基因:二氢黄酮醇还原酶基因 :无色花青素双加氧酶基因 :转录因子 :蔗糖转运蛋白基因 :蔗糖磷酸合成酶基因 :酸性转化酶基因 :中性转化酶基因 .下同 .数据分析采用 .软件进行数据统计学分析采用 多重比较法(.)进行差异显著性分析利用 软件绘图图 处理对不同葡萄品种果实外观的影响 )为表 中对应的 个葡萄品种 .):果实转色初期 :果实转色期 :果实始熟期 :果实成熟期 .):处理组 :对照组 .下同 .结果与分析.外源 处理对 个葡萄品种果实品质的影响.色泽指数()由图 和图 可知:外源 处理能够促进天使玫瑰香秀特玫瑰和超宝 个无色品种由绿色转为黄色同时也能促进牡丹红等有色品种着色 测定结果显示 处理后除沪培 号外大多数葡萄品种转色期后 显著增加其中黑玫瑰 增加幅度 第 期杨思玲等:氨基乙酰丙酸处理对葡萄果实品质及相关基因表达的影响最明显为.黑汉 与对照相比差异最大达.在果实成熟期()与对照相比巨玫瑰 增加幅度最大达.黑玫瑰次之为.图 处理对不同葡萄品种色泽指数()的影响 ()分别为果实膨大期、果实膨大期、果实转色初期、果实转色期、果实始熟期、果实成熟期.下同 .可溶性固形物与可溶性糖含量 由图 可见:葡萄果肉可溶性固形物含量随着果实发育和成熟逐渐上升 处理后除摩尔多瓦天使玫瑰香和秀特玫瑰外其他品种果实可溶性固形物含量均较对照有不同程度的增加 在果实成熟期 处理组中巨玫瑰果实可溶性固形物含量最高达.黑玫瑰次之达.均显著高于对照由图 可见:种可溶性糖(葡萄糖和果糖)含量在葡萄果实发育过程中的变化趋势大致相同且与可溶性固形物变化趋势类似 处理后有色品种蓓蕾玫瑰 巨玫瑰沪培 号黑玫瑰牡丹红紫鸡心和无色品种超宝的可溶性糖含量均快速增加在果实成熟期这些品种果肉中均积累大量的可溶性糖除紫鸡心可溶性糖含量与对照相比无明显差异外其余品种可溶性糖含量均显著高于对照南 京 农 业 大 学 学 报第 卷图 处理对不同葡萄品种果肉可溶性固形物含量的影响 .花色苷含量 由图 可见:天使玫瑰香秀特玫瑰和超宝 个无色品种中总花色苷含量很低未达到检测限故没有深入分析 除紫鸡心外其余有色品种经 处理后自转色期开始果皮中总花色苷含量均高于对照 在果实成熟期哈佛德黑汉和黑玫瑰 个深色品种果皮中总花色苷含量分别较对照增加.、.和.沪培 号与红奥林 个鲜红色品种果皮中总花色苷含量分别较对照增加.和.倍花色苷组分主要包括矢车菊素、飞燕草素、锦葵素、天竺葵素、芍药素和矮牵牛素 大类 根据葡萄果皮颜色类型随机选取无色品种天使玫瑰香、浅色品种安芸皇后和沪培 号以及深色品种巨玫瑰和紫鸡心作为代表性品种进行花色苷组分及其含量分析 结果(表)显示葡萄果皮中共检测到 种花色苷 处理后 个有色品种果皮中花色苷总量均增加其中巨玫瑰和沪培 号分别较对照增加了.和.沪培 号果皮中含量最高的花色苷是飞燕草素类较对照显著增加.增加幅度最明显的是矮牵牛素二葡萄糖苷达.矮牵牛素(咖啡酰葡萄糖苷)次之为.经 处理后紫鸡心锦葵色素类花色苷含量最高与对照相比显著增加.增加幅度最明显的是锦葵色素二葡萄糖苷达.锦葵色素(乙酰葡萄糖苷)次之为.天使玫瑰香为黄绿色品种果皮中仅检测到飞燕草素葡萄糖苷及芍药素肉桂酰葡萄糖苷且这 种花色苷组分的含量在对照与处理组之间均无明显差异 第 期杨思玲等:氨基乙酰丙酸处理对葡萄果实品质及相关基因表达的影响图 处理对不同葡萄品种果肉可溶性糖含量的影响 、分别表示 处理组葡萄糖和果糖含量、分别表示对照组葡萄糖和果糖含量 .外源 处理对 个代表性葡萄品种果实品质相关基因表达水平的影响.糖代谢相关基因 由图 可见:处理后 个代表性品种果肉中糖代谢相关基因(、和)表达水平出现不同程度变化 与对照相比处理组中 在安芸皇后和紫鸡心果肉发育过程中以下调表达为主在巨玫瑰天使玫瑰香和沪培 号果肉发育过程中以上调表达为主处理组中 在安芸皇后巨玫瑰和紫鸡心果肉发育过程中以下调表达为主在天使玫瑰香和沪培 号果肉发育过程中以上调表达为主处理组中 在安芸皇后巨玫瑰沪培 号和紫鸡心果肉发育过程中以下调表达为主在天使玫瑰香果肉发育过程中以上调表达为主 基因表达在不同品种间的变化趋势存在差异