2种基质种植下石斛根系内生菌多样性分析.pdf

54卷南 方 农 业 学 报 11862种基质种植下石斛根系内生菌多样性分析柳芳洲1，游胜方2，申知煦2，龙丽2，李小兰1，王倩1，何芋岐3，秦琳3，胡欢1*（1遵义医科大学口腔医学院/贵州省普通高等学校微生物资源与药物开发特色重点实验室，贵州遵义563000；2遵义医科大学第一临床学院，贵州遵义563000；3遵义医科大学药学院，贵州遵义563000）摘要：【目的】阐明不同基质种植下石斛根系内生菌菌群的差异性，为进一步研究内生菌组成差异对石斛药效成分积累的影响、优化种植条件提供参考依据。【方法】选取仿野生贴石种植于丹霞石块和火山石块的2年生石斛根系，进行16S rRNA V4区域和ITS 2区域的高通量测序，分析2种基质种植下石斛根系内生细菌和内生真菌的次生代谢产物、群落组成结构、alpha多样性、beta多样性和功能预测。【结果】火山石与丹霞石的石斛根系次生代谢产物中倍半萜糖苷类物质Dendromoniliside C or isomer（288-p）和Dendromoniliside D or isomer（123-n）差异显著（P0.05，下同）。群落结构分析显示，内生细菌和内生真菌的组成在门水平和属水平上均无明显差异，其中，内生细菌在门水平上均以变形菌门（Proteobacteria）相对丰度最为富集，在属水平上均以鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）相对丰度最为富集；内生真菌在门水平上均以子囊菌门（Ascomycota）为绝对优势门，在属水平上均以暗球腔菌属（Phaeosphaeria）为优势菌群。主成分分析反映火山石与丹霞石样本组间差异明显，基于ANOSIM组间差异检验下的Unweighted UniFrac指数、Bray Curtis指数和Jaccard指数均进一步表明不同基质种植下石斛内生菌的组间差异远大于组内差异。功能预测结果显示，在2种基质下石斛根系中，内生菌真菌营养型以病理腐生营养型（Pathotroph-Saprotroph）和腐生营养型（Sa-protroph）差异最显著，在主要功能通路中真菌寄生植物病原植物腐生菌功能群（Fungal Parasite-Plant Pathogen-Plant Saprotroph）和未定义腐生菌功能群（Undefined Saprotroph）差异显著，均为丹霞石显著高于火山石。【结论】2种基质种植环境显著影响石斛根系内生菌群的次级代谢产物、菌群相对丰度、优势菌群和群落功能。同时也提示，石斛根系内生真菌相较于内生细菌，对不同种植基质条件更敏感。关键词：石斛；基质；根系内生微生物；功能预测中图分类号：S567.239文献标志码：A文章编号：2095-1191（2023）04-1186-12收稿日期：2022-12-22基金项目：国家自然科学基金项目（31860104）；贵州省科技计划项目（黔科合基础-ZK 2022 591）；遵义市科技计划项目（遵市科合HZ字 2018 17号，遵市科合HZ字 2020 88号）通讯作者：胡欢（1990-），https:/orcid.org/0000-0002-5053-3361，博士，高级实验师，主要从事环境微生物资源挖掘研究工作，E-mail：第一作者：柳芳洲（1996-），https:/orcid.org/0009-0003-3260-7827，研究方向为微生物组资源挖掘，E-mail：Diversity analysis of endophytic microbes in roots ofDendrobium nobile（Lindl.）（Orchidaceae）on two substratesLIU Fang-zhou1，YOU Sheng-fang2，SHEN Zhi-xu2，LONG Li2，LI Xiao-lan1，WANG Qian1，HE Yu-qi3，QIN Lin3，HU Huan1*（1School of Stomatology，Zunyi Medical University/Microbial Resources and Drug Development Key Laboratory ofGuizhou Tertiary Institution，Zunyi，Guizhou 563000，China；2The First Clinical Institute，Zunyi Medical University，Zunyi，Guizhou 563000，China；3School of Pharmacy，Zunyi Medical University，Zunyi，Guizhou 563000，China）Abstract：【Objective】This study was conducted to clarify the diversity of endophytic flora in roots of Dendrobiumnobile（Lindl.）（Orchidaceae）cultivated on two different substrates，so as to provide reference for investigating the influenceof differences in endophytic composition on the accumulation of effective medicinal components of D.nobile，as wellas optimizing planting conditions.【Method】Two-year D.nobile root samples planted on Danxia stone and volcanic stonesubstrates were selected for high-throughput sequencing of the V4 region and ITS2 region of 16S rRNA.The secondarymetabolites，microbial composition，alpha diversity，beta diversity，and function prediction analysis of endophytic bacteriaand endophytic fungi in D.nobile roots were performed.【Result】Dendromoniliside C or isomer（288-p）and Dendromo-niliside D or isomer（123-n），two representative sesquiterpene glucosides，were significantly different in roots of D.nobile南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023，54（4）：1186-1197ISSN 2095-1191；CODEN NNXAABhttp:/DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.04.0234期11870引言【研究意义】石斛（Dendrobium nobile Lindl.），即金钗石斛，为兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendro-bium Sw）植物，是中国药典收录石斛的基源植物之一（中国科学院中国植物志编辑委员会，1999；国家药典委员会，2020）。现代药理研究表明石斛碱等药用活性成分在增强免疫、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、延缓凝血、改善消化系统及治疗白内障等方面具有较好的效果（马伟凤和徐勤，2010；何沁嶷，2016）。依据2019年 濒危野生动植物种国际贸易公约（CITES）附录，野生石斛因生境的退化或丧失遭到严重破坏而成为濒危野生植物。因此，迫切需要加强对野生石斛生境的保护重建，同时科学发展石斛人工种植产业，也是高效发掘石斛资源的药用经济价值一个重要途径。已有研究发现不同附生基质会影响石斛代谢产物的积累（胡媛等，2022），进而影响药化成分活性。深入研究不同附生条件影响石斛代谢产物的作用机制，精准探索最佳培育条件，使栽培过程中药效成分得到高效积累，对全力开发石斛药用经济价值和合理利用其生态资源具有重要意义。【前人研究进展】植物内生菌指其生活史部分或整个阶段在健康植物组织或细胞内，并对宿主不引起明显病症的一类微生物（Hyde and Soytong，2008）。植物内生菌可促进宿主生长和发育（Singh et al.，2011），影响次生代谢产物的积累，在植物微生态系统中具有重要作用（Singh and Gaur，2016）。但不同种植条件下石斛根系内生微生物组成的差异性规律尚未得到阐明，同时这种差异与药效成分差异的相关性亦无涉及。药用植物的内生菌也具有独特的、丰富的次级代谢产物，并从中发现了许多与宿主相同或相似的生物活性物质，这些次生代谢产物具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等方面的药理活性（邱玲等，2018；Sarsaiya et al.，2020）。例如，从石斛茎段分离纯化的内生真菌Trichoderma longibrachiatum MD33菌株代谢产物中发现与植物源石斛碱相似的成分，其对植物病原菌具有一定的抑菌作用，提示植物内生菌是一个取之不尽、用之不竭的天然化合物生产库（Wang et al.，2019）。本课题组前期调研发现，国内两大重要石斛种植基地贵州赤水和海南海口采用不同的贴石生长基质，前者采用丹霞石块，后者则采用火山石块。海拔是影响石斛石斛碱积累的重要因素，生长在贵州赤水海拔692 m的石斛中石斛碱含量明显优于其他低海拔地区（陆安静，2020）。进一步在贵州赤水信天石斛种植基地引入海口基地的火山石作为贴石种植基质，在同质化种植条件下，对相同高海拔下丹霞石和火山石的2年生石斛茎段取样，检测到其石斛碱含量在2种基质种植下无显著差异（火山石vs丹霞石：0.58%vs 0.49%，P=0.2222），但次生代谢产物（2种倍半萜糖苷类化合物）则差异显著。【本研究切入点】目前石斛不同培育技术的研究较多，但从根系内生菌的差异性层面分析其对石斛次生代谢产物影响的研究较少。【拟解决的关键问题】选取最优海拔栽培环境，应用同质化栽培技术，基于高通量测序基础上深入探究不同种植条件对石斛根系内生菌群结构特征的影响，为石斛资源开发利用提供内生菌方面的上游理论支持，也为植物内生菌具有影响植物次生代谢产物的潜力提供依据。1材料与方法1.1采样及次生代谢产物含量测定于2021年5月采集石斛茎段样本，选取贵州省cultivated at Danxia stone and volcanic stone（P2，差异倍数|Fold Change|1且P2）。最后，使用PICRUSt2和FUNGuild分别对内生细菌和内生真菌进行功能预测。2结果与分析2.1不同附生基质对石斛次生代谢产物谱的影响本研究中共检测到石斛次生代谢产物802个，其中，正离子模式下512个产物，负离子模式下290个产物。为找出显著影响次生代谢产物积累的附生基质，取VIP1.0、P0.05作为筛选标准，得到组间差异次生代谢产物共72种。其中，21种成分上调表达，绝大多数为正离子模式产物，51种成分下调表达（图1）。差异次生代谢产物中倍半萜糖苷类物质为Dendromoniliside C or isomer（288-p）和Dendromo-niliside D or isomer（123-n），火山石组的123-n含量4期1189显著高于丹霞石组（P0.05，下同），而在丹霞石组的288-p含量更高（图2）。2.22种基质种植下石斛根系内生菌OTUs统计内生细菌利用高通量测序技术总共获得869626条高质量序列，火山石和丹霞石组分别获得427877和441749条序列，内生真菌测序共获得644197条Clean序列，其中火山