“α-螺旋主导蛋白质的圆二色光谱测定”实验室间比对项目统计结果分析——基于经典统计法.pdf

实 验 技 术 与 管 理 第 40 卷 第 6 期 2023 年 6 月 Experimental Technology and Management Vol.40 No.6 Jun.2023 收稿日期:2022-12-29 基金项目:国家自然科学基金项目（52176110）作者简介:程红（1976），女，湖北天门，硕士，高级工程师，长期从事光谱仪器分析，。通信作者:曾艳（1973），女，北京，学士，处长，主要研究方向为高校实验室安全管理、高校检验检测机构管理，。引文格式:程红，严定策，宋武林，等.“-螺旋主导蛋白质的圆二色光谱测定”实验室间比对项目统计结果分析：基于经典统计法J.实验技术与管理,2023,40(6):1-5.Cite this article:CHENG H,YAN D C,SONG W L,et al.Statistic result analysis of inter laboratory comparison in“measurement of a helical predominate protein by circular dichroism spectroscopy”:Based on classical statistic methodsJ.Experimental Technology and Management,2023,40(6):1-5.(in Chinese)ISSN 1002-4956 CN11-2034/T DOI:10.16791/ki.sjg.2023.06.001 特约专栏实验室间比对方法应用 编者按：由于不同实验室在测量仪器、条件、方法、操作等方面的差异性，导致了实验结果的不可比性，为了有效验证和比对实验数据，并建立统一的标准，实验室间比对分析就显得尤为重要。本期专栏特别推出华中科技大学和中国科学技术大学经验，通过圆二色光谱测定和热分析实验介绍了实验室间比对方法的应用，以期为实验室发展提供参考。“-螺旋主导蛋白质的圆二色光谱测定”实验室间比对项目统计结果分析 基于经典统计法 程 红1，严定策1，宋武林1，孔 翦2，曾 艳2（1.华中科技大学 分析测试中心，湖北 武汉 430074；2.教育部高等学校科学研究发展中心，北京 100080）摘 要：圆二色（CD）光谱是一种广泛使用的测量蛋白质结构和构象变化的方法，可以提供除其他生物物理、化学和结构生物学技术以外的辅助结构信息。为了评价各实验室间 CD 测量结果的准确性，实施了 2022 年度高校实验室间比对项目“-螺旋主导蛋白质的圆二色光谱测定”，项目以一种-螺旋为主导的蛋白质（细胞色素 C）在波长 222 nm 处的圆二色值作为考核参数，共有来自12 个国内高校测试平台和科研院所的实验室参加了此次比对活动。通过基于经典统计法对比对数据的统计分析，表明各参加实验室测量结果偏差均在可接受范围之内，有效验证了不同实验室间进行 CD 光谱测量的可比性和可靠性。关键词：-螺旋主导蛋白质；圆二色光谱；实验室间比对；-螺旋；可比性 中图分类号：O657.3 文献标识码：A 文章编号：1002-4956(2023)06-0001-05 Statistic result analysis of inter laboratory comparison in“measurement of-helical predominate protein by circular dichroism spectroscopy”:Based on classical statistic methods CHENG Hong1,YAN Dingce1,SONG Wulin1,KONG Jian2,ZENG Yan2(1.Analytical and Testing Center,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430074,China;2.Center for Scientific Research and Development in Higher Education Institutes,Ministry of Education,Beijing 100080,China)Abstract:Circular dichroism(CD)spectroscopy is a widely-used method for examining the structures and conformational changes of proteins,provides complementary structure information to that obtainable by other 2 实 验 技 术 与 管 理 biophysical,chemical,and structural biology techniques.In order to evaluate the consistency of CD measurement results among laboratories and ensure the accuracy and reliability of the measurement results,in 2022,the inter laboratory comparison project“Measurement of a-helical predominate protein by circular dichroism spectroscopy”is organized.The project is carried out to compare the CD spectral magnitude of cytochrome C,a-helical predominate protein,in wavelength of 222 nm.12 test platforms of domestic university and laboratories of scientific research institutes participated in this comparison.Through the effective implementation of the comparison scheme and the statistical calculation of the comparison data based on classical statistic methods,it is found out that the deviation of the measurement results of each participant laboratory is within the acceptable range,which verifies the comparability and reliability of CD spectrum measurement between different laboratories.Key words:-helical predominate protein;circular dichroism spectroscopy;inter laboratory comparison;-helix;comparability 对于由手性亚基组成的蛋白质等生物分子，其多肽骨架中酰胺和羰基的吸收在被圆偏振光照射时会产生近紫外和远紫外波长范围内的信号。圆二色（circular dichroism，CD）光谱技术利用发色团对左右圆偏振光的不同吸收原理，获得蛋白质构象的结构信息1-2。CD光谱基于远紫外波长区域（约 260170 nm）中电子跃迁的原理辨别蛋白质的二级结构，基于近紫外区域（约300260 nm）来监测芳香族氨基酸残基的局部三级结构环境，是考察蛋白质和多肽等生物分子的物理或化学环境、氨基酸组成（如突变）或分子间相互作用的有力工具3-4。在过去的十年中，已经发表了 24 000多篇使用 CD 光谱联合其他技术如晶体学5、低温电子显微镜6、核磁共振波谱7-8、傅里叶变换红外光谱6,8、振动圆二色光谱9、摩尔动力学模拟10和小角散射11等来共同表征多肽和蛋白质结构的研究论文。由于蛋白质主链肽键中的单线态电子跃迁发生在190 和 222 nm 附近（酰胺生色团 NC=O），因此远紫外区的 CD 光谱更受关注。222 nm 附近的跃迁是由于 O 原子上的孤对电子跃迁到反键轨道（n-*跃迁）所致，190 nm 附近的跃迁是由于非键轨道到反键轨道的跃迁（-*跃迁）引起的。这两种跃迁在蛋白质的手性环境中混合，导致各种蛋白质呈现不同的二级结构光谱。对于以-螺旋为主导的蛋白质，-*跃迁裂分导致其 CD 光谱中出现 190 nm 处的正峰和 208 nm处的负峰，n-*跃迁则表现为谱图中 222 nm 的负峰12-13。在实际应用中，CD 信号强度（即圆二色值）在对蛋白质/多肽（尤其是螺旋特征）的二级结构定性和定量分析中起着关键作用13-14。然而，CD 光谱技术自得到广泛应用以来，一直没有很好地建立测量结果的溯源性。如果测量不可溯源，则在不同实验室、不同仪器、不同时间、不同条件下进行的测量就不具有可比性15。因此，十分有必要对国内的圆二色光谱用户尤其是提供测试服务的仪器平台如分析测试中心开展此类项目的实验室间比对，最终在测量机构和更广泛的用户群体中逐步实现可比的 CD 测量。国际上，国际计量委员会物质量咨询委员会（CCQM）多次开展 CD 光谱仪测试的比对活动，其中在 2010 年编号为CCQM-P59 的国际比对项目“圆二色光谱仪测定蛋白质结构”中16，发现 CD 光谱实验室间数据缺乏可比性，但是认为变量因素与样品相关，可以使用更加详细的作业指导书来避免。我国之前还没有机构组织过关于 CD 光谱仪的实验室间比对活动。2022 年，在组织专家系统论证比对方案后，由教育部高等学校科学研究发展中心、国家计量认证高校评审组组织，华中科技大学分析测试中心承担并负责实施了 2022 年度高校实验室间比对项目“-螺旋主导蛋白质的圆二色光谱测定”。本项目根据 GB/T 270432012合格评定能力验证的通用要求和 JY/T 05722020 圆二色光谱分析方法通则 设计比对方案和制定作业指导书，以一种-螺旋主导蛋白样品细胞色素 C 为样品，要求参加比对的实验室使用作业指导书中的方法和参数检测该蛋白 222 nm 特征谱带处的圆二色值数据（）。此项比对活动不同于历年国际比对的项目，为首次使用圆二色光谱仪测试圆二色值的比对。一般情况下，实验中的 值和 CD 吸光度的差值（A）不在实验室之间或实验室内进行比较，但在前期蛋白质的圆二色光谱测量中圆二色值不确定度评估的基础上，考虑所用比色皿的光程长度、仪器的校准状态和溶液的浓度，得以顺利开展此项实验室间比对活动，并通过本次比对活动了解高校实验室进行圆二色光谱测试的相关技术能力，为圆二色光谱仪测试的可比性和可靠性评估提供参考。1 实验部分 1.1 比对方案 截至 2020 年的不完全统计，我国现有圆二色光谱仪的主流厂商有两家：日本 JASCO 公司，英国应用光物理（Applied Photophysics,APP）公司，两家各种不同仪器型号共计约 200 台圆二色光谱仪为高校和科研院所持有。考虑到仪器类型的差异及可能对测试结果有重大影响的因素，对于参加本项目的实验室，我们统一随样品一起发放了用于校准仪器的标准样品，在进 程 红，等：“-螺旋主导蛋白质的圆二色光谱测定”实验室间比对项目统计结果分析基于经典统计法 3 行样品测试前，先使用标准样品校准仪器，然后测试样品，再对其结果进行统计分析。本次实验室间比对要求参加比对的实验室（以下简称“参加实验室”）严格按照作业指导书中的相关参数设置和检测程序完成