吡咯喹啉醌对UVB诱导的人皮肤成纤维细胞早衰的抑制作用.pdf

*基金项目南通市卫生健康委员会科研课题(QA2021043)袁南通市科技计划项目(MS22022102)袁江苏省研究生科研与实践创新计划项目(SJCX21_1456)袁国家自然科学基金资助项目(81903246)*作者简介王静袁女袁汉族袁1999 年 10 月袁江苏省宿迁市人袁硕士在读袁研究方向院皮肤光损伤相关研究遥施智男袁男袁汉族袁1993 年 4 月袁江苏省南通市人袁硕士在读袁研究方向院皮肤光损伤相关研究遥#为共同第一作者遥*通信作者周舒袁电话院0513-89093893袁E-mail:南 通 大 学 学 报 渊 医 学 版 冤Journal of Nantong University(Medical Sciences)2023 颐 43渊3冤DOI:10.16424/32-1807/r.2023.03.006引文格式院 王静,施智男,谷丽,等.吡咯喹啉醌对 UVB 诱导的人皮肤成纤维细胞早衰的抑制作用J.南通大学学报(医学版),2023,43(3)颐224-229.吡咯喹啉醌对 UVB 诱导的人皮肤成纤维细胞早衰的抑制作用*王静1,2*#袁施智男1,2*#袁谷丽1袁翟小玉1,2袁徐智怡1,2袁赵静婷1袁顾丽群1袁花卉1袁周舒1*(1江苏省南通市第三人民医院袁南通大学附属南通第三医院皮肤科袁南通 226006曰2南通大学医学院)摘要目的院探究吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinine,PQQ)对中波紫外线(ultraviolet B,UVB)诱导的人皮肤成纤维细胞早衰的影响遥方法院采用不同浓度(10尧30尧50尧60尧100 滋mol/L)PQQ 处理成纤维细胞 24 h袁使用 CCK-8 法检测细胞活力袁筛选最适 PQQ 浓度遥 将成纤维细胞分为对照组尧PQQ 组尧光老化+PQQ 组和光老化组遥 用 UVB 照射诱导人成纤维细胞提前衰老模型袁后予 50 滋mol/L PQQ 处理 24 h遥 采用流式细胞仪检测细胞周期曰茁-半乳糖苷酶(茁-galacsidase,SA-茁-Gal)染色观察细胞衰老曰Western Blot 法检测 p16尧p21尧p53 蛋白质在细胞内的表达情况曰实时定量 PCR(quantitativereal-time PCR,qRT-PCR)法检测玉型胶原(type 玉 collagen,COL-)尧芋型胶原(type 芋 collagen,COL-)尧基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinases-1,MMP-1)和基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinases-3,MMP-3)mRNA 表达水平遥结果院与光老化组比较袁光老化+PQQ 组细胞形态改善袁细胞间隙减小袁SA-茁-Gal 阳性表达细胞减少袁细胞增殖活性提高袁细胞周期阻滞改善袁p16尧p21 和 p53 蛋白表达减少袁COL-尧COL-mRNA 表达量增加袁MMP-1 和 MMP-3 mRNA 表达降低遥 结论院PQQ 对 UVB 诱导的人成纤维细胞提前衰老有抑制作用袁其可能通过下调衰老相关蛋白 p16尧p21尧p53 的水平袁调控 MMP-1尧MMP-3尧COL-和 COL-的基因表达而发挥光保护作用遥关键词成纤维细胞曰皮肤曰细胞早衰曰吡咯喹啉醌曰中波紫外线中图分类号R751文献标志码A文章编号1674-7887渊2023冤03-0224-06Inhibitory effect of pyrroloquinoline quinone on UVB-induced premature agingin human skin fibroblasts*WANG Jing1,2*#,SHI Zhinan1,2*#,GU Li1,ZHAI Xiaoyu1,2,XU Zhiyi1,2,ZHAO Jingting1,GU Liqun1,HUA Hui1,ZHOUShu1*(1Department of Dermatology,Nantong Third People忆s Hospital,Jiangsu Province,Affiliated Nantong Hospital 3 ofNantong University,Nantong 226006;2Medical School,Nantong University)AbstractObjective:To investigate the effect of pyrroloquinoline quinine(PQQ)on ultraviolet B(UVB)-induced prematureaging in human skin fibroblasts.Methods:Fibroblasts were treated with different concentrations(10,30,50,60,100 滋mol/L)ofPQQ for 24 h,and the viability of cell was studied by CCK-8 assay,and the appropriate concentration for drug treatment wasscreened.Fibroblasts were divided into control group,PQQ group,photoageing+PQQ group and photoageing group.UVB irra鄄diation was used to establish a cellular photoaging model.The model were next treated with PQQ(50 滋mol/L)for 24 h.Cellu鄄lar cycle was evaluated by flow cytometry.Cellular senescence was observed by 茁-galacsidase(SA-茁-Gal)staining and theexpression of p16,p21,p53 proteins in cells were detected by Western Blot.The expression of type 玉 collagen(COL-),type 芋 collagen(COL-),matrix metalloproteinases-1(MMP-1)and matrix metalloproteinases-3(MMP-3)was quantified byquantitative real-time PCR(qRT-PCR)analysis.Results:Compared with the photoageing group,the cell morphology improved,the intercellular space decreased,the positive expression of SA-茁-Gal decreased,cell proliferation activity increased,cell cyclearrest decreased,the expression of p16,p21 and p53 proteins decreased,the expression of COL-and COL-increased,and the expression of MMP-1 and MMP-3 decreased in photoageing+PQQ group.Conclusion:PQQ protects skin fibroblastsagainst UVB-induced photoaging by restraining activation of p16,p21 and p53,and regulating the expression of MMP-1,MMP-3,COL-and COL-.Key wordsfibroblasts;skin;premature aging;pyrroloquinoline quinone;ultraviolet B224窑窑皮肤老化是许多内源性因素和外源性因素共同作用的结果，紫外线是皮肤衰老的最主要外源性因素1。波长为 280320 nm 的中波紫外线(ultravioletB,UVB)能量高、生物活性强，能穿过表皮并到达真皮层上部，长时间照射可导致皮肤干燥、粗糙、红斑、皱纹、色素沉着、癌前病变，甚至皮肤癌2-3，其机制可能与氧化应激、炎症反应激活、细胞外基质(extracel原lular matrix,ECM)降解、DNA 损伤相关4-5。人真皮成纤维细胞(human dermal fibroblasts,HDF)是皮肤真皮层的主要细胞成分，在细胞水平上反映皮肤的衰老状态，亦是 UVB 辐射的靶细胞。紫外线辐射可诱导 HDF 进入早衰状态，导致细胞增殖抑制，多种生物学指标出现异常。吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinine,PQQ)是一种细菌脱氢酶的氧化还原辅助因子，广泛存在于自然界，影响许多生理和生化过程，包括调节氧化还原平衡、促进细胞增殖、改善线粒体功能等6-7。既往研究8-11表明，PQQ 的多种生物学功能不仅表现在抗骨质疏松、心血管和神经保护方面，在抗肿瘤、抗炎、免疫调节，甚至抗衰老、防辐射方面也展现出潜在作用。大量补充 PQQ 时，在皮肤和肾脏分布较多12。这提示 PQQ 可能对皮肤光老化可能具备保护作用。本研究以 HDF 为研究对象，用 UVB 照射培养的 HDF建立早衰模型，探究 PQQ 对 UVB 诱导 HDF 早衰的作用及其相关机制，为抗光老化产品的研究提供理论依据。1材料和方法1.1材料来源HDF 由南通大学附属南通第三医院提供的健康儿童包皮组织体外分离培养。该研究已通过南通大学附属南通第三医院伦理委员会审核(E2019001)。PQQ 购于上海源叶生物科技有限公司；胎牛血清购于杭州天杭生物科技股份有限公司；DMEM 培养液购于美国 Gibco 公司；CCK-8 试剂盒、细胞衰老 茁-半乳糖苷酶(茁-galacsidase,SA-茁-Gal)染色试剂盒、胰蛋白酶、RIPA 缓冲液、BCA 试剂盒、GAPDH 抗体均购于上海碧云天生物公司；实时定量 PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)引物合成于上海生工公司北京分部；p16、p21、p53抗体购于美国 Abcam 公司；UVB 荧光灯、紫外线辐射强度仪(UV-B DIGITAL RADIOMETER)由上海希格玛高技术有限公司提供；Tanon5200 全自动化学发光/荧光图像分析系统由上海天能科技有限公司提供。1.2方法1.2.1细胞培养取健康儿童包皮组织修剪皮下组织并剪成约 5 mm伊5 mm 大小皮片，碘附浸泡 10 min后，用含 1%青链双抗的 PBS 反复冲洗 3 次至无肉眼可见血迹，加入 0.5%Dispase 酶消化液，4 益下消化 12 h 后，分离表皮和真皮，弃表皮，真皮部分加入0.1%胶原酶消化液，37 益下消化 1 h 后，加入含10%胎牛血清及 1%青霉素-链霉素双抗的 DMEM培养基，轻轻吹打后用 200 目尼龙网过滤，细胞悬液 1 500 r/min 离心 5 min，弃上清，吹打混匀后转移至培养皿中，37 益，5%CO2条件下用含 10%胎牛血清及 1%青霉素-链霉素溶液的 DMEM 培养基培养。取 410 代对数生长期细胞进行实验，细胞每天换液 1 次。1.2.2CCK-8 法测定细胞增殖活性将细胞以2 000 个/100 滋L 接种于 96 孔板内，置于 5%CO2、37 益、饱和湿度下培养，待细胞生长至 80%，每孔加入不同浓度(10、30、50、60、100 滋mol/L)的 PQQ 孵育2 h 后更换为完全培养基，每个浓度设