白藜芦醇_siRNA胶束复合物的载药和释药性能研究.pdf

1第35卷 第2期2023年VOL.35NO.22023菏 泽 医 学 专 科 学 校 学 报JOURNALOFHEZEMEDICALCOLLEGEDOI:10.3969/j.issn.1008-4118.2023.02.001*白藜芦醇/siRNA 胶束复合物的载药和释药性能研究贾莉，苗方，张卫敏，安芸，董晓辉，马兰（菏泽医学专科学校，山东 菏泽 274000）摘要：目的 研究 pH 和还原性双响应白藜芦醇/siRNA 胶束复合物（MCpH/RedoxRes-siRNA）的载药和释药性能。方法 采用紫外分光光度法和荧光分光光度法分别建立白藜芦醇（Resveratrol，Res）和 FAM-siRNA 体外分析方法，超速离心法和超滤离心法测定 MCpH/RedoxRes-siRNA 中药物的包封率（Encapsulation Efficiency，EE%）和载药量（Drug Loading，DL%），透析法测定 MCpH/RedoxRes-siRNA 中药物的释放性能。结果 Res 和 FAM-siRNA 的体外分析方法均符合方法学要求；MCpH/RedoxRes-siRNA中Res的EE%为（92.21.74）%、DL%为（9.721.63）%，FAM-siRNA 的EE%为（94.51.42）%；MCpH/RedoxRes-siRNA中Res释放具有pH敏感性，siRNA的释放呈现pH和还原环境依赖性，在pH 5.5和还原性环境中，Res 和 FAM-siRNA 释放较为迅速和完全。结论 MCpH/RedoxRes-siRNA 具有较好的Res 和 siRNA 载药性能和释放性能。关键词：胶束复合物；载药性能；释药性能中图分类号：R285 文献标识码：A 文章编号：1008-4118（2023）02-0001-04Study on drug loading and drug release properties of Resveratrol/siRNA micellar polyplexesJIA Li,MIAO Fang,ZHANG Weimin,AN Yun,DONG Xiaohui,MA Lan（Heze Medical College，Heze 274000，Shandong）Abstract:Objective To study the drug loading and drug release properties of pH and reducing double-responsive Resveratrol/siRNA micellar polyplexes(MCpH/RedoxRes-siRNA).Methods UV spectrophotometry and fluorescence spectrophotometry were established for Resveratrol(Res)and FAM-siRNA in vitro respectively.Encapsulation Efficiency(EE%)and Drug Loading(DL%)of Res and FAM-siRNA in MCpH/RedoxRes-siRNA were determined by ultrafiltration centrifugal method and ultrafiltration centrifugal method.The drug release properties in MCpH/RedoxRes-siRNA was detected by dialysis.Results The EE%of Res and DL were(92.21.74)%,(9.721.63)%in MCpH/RedoxRes-siRNA.The EE%of FAM-siRNA were(94.51.42)%.The release of Res in MCpH/RedoxRes-siRNA was pH-responsive,and the release of siRNA is pH and reducing environment dependent.In pH5.5 and reducing environment,the release of Res and FAM-siRNA is rapid and complete.Conclusion MCpH/RedoxRes-siRNA have good Res and siRNA delivery and release properties.Key words:Micellar polyplexes;Drug load property;Drug release property基金项目：山东省中医药科技项目(2021M204)基聚乙二醇-聚丙交酯-聚组氨酸-（二硫键合）-聚乙烯亚胺（mPEG-b-PLA-PHis-ss-OEI）共聚物，利用 OEI 与 siRNA 之间的静电作用力，制备并研究了单独包载 siRNA 的递送系统2。由于共聚物中具有疏水嵌段 PLA 和 PHis，可包载疏水性中药单体 Res 和 siRNA 形成胶束复合物 MCpH/抗肿瘤治疗中，利用纳米载体共递送药物可实现肿瘤多靶点精准靶向、高渗透性、快速高效的细胞摄取、降低毒副作用，达到协同抗癌作用1。然而，联合递送药物的载药和释药性能是共递送药物发挥抗肿瘤治疗作用的前提和关键。本研究前期成功合成了 pH 和还原性双响应功能的单甲氧2 第35卷 第2期2023年VOL.35NO.22023菏 泽 医 学 专 科 学 校 学 报JOURNALOFHEZEMEDICALCOLLEGERedoxRes-siRNA。本研究深入研究了 MCpH/RedoxRes-siRNA 的载药和释药性能，为其实现共递送药物应用于抗肿瘤治疗研究奠定了坚实的制剂基础。1仪器与试药DL-180 型超声仪（浙江省象山县石浦海天电子仪器厂）；超高速低温离心机（美国贝克曼公司）；FA 1104 电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；TDL-16B 台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；微量移液器（美国Thermo公司）；SPR-DT12A 药物溶出度仪（天津赛普瑞实验设备有限公司）；RE-52AA 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪华仪器厂制造）。MCpH/RedoxRes-siRNA（实验室自制，批 号 20210103）；FAM-siRNA（上 海 吉玛 制 药 技 术 有 限 公 司，Sense strand5-3：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，5-3：ACGUGACACGUUCGGAGAATT)；白藜芦醇（纯度 99%，上海阿拉丁试剂有限公司），Amicon Ultra-4 超滤管（NMWL=50 kD）；透析袋（进口分装，上海绿鸟科技有限公司）；甲醇、乙腈、PBS 缓冲液等试剂（分析纯，国药化学试剂有限公司）。2方法2.1 Res 体外分析方法的建立3 配制一定浓度的Res、FAM-siRNA 和空白胶束的溶液，以甲醇为空白对照，于 200 800 nm 波长范围内扫描并绘制紫外-可见吸收光谱。Res 在 306 nm 波长处有最大吸收，FAM-siRNA 和空白胶束在此处均无吸收，因此确定 306 nm 为 Res 的检测波长。该方法专属性符合要求。取 Res 适量，精密称定后，配置成浓度约 1.0 mg/mL 的 Res 甲醇储备液。精密量取 Res 甲醇储备液溶液适量，加甲醇溶液配置成系列浓度的Res 标准溶液。紫外分光光度法（检测波长为 306 nm）测定系列浓度 Res 标准溶液的吸光度值 A，绘制吸光度值 A-浓度 C 标准曲线。取高、中、低浓度的 Res 标准溶液各 5 份，测定日内和日间精密度。取适量空白胶束和 FAM-siRNA 混合溶液，加入适量 Res 标准溶液，测定并计算回收率。上述实验均重复 3 次。2.2 FAM-siRNA 体外分析方法的建立4 取 1 OD FAM-siRNA 粉末加入 125 L DEPC 水溶液溶解，配 置 成 FAM-siRNA 储 备 液。取 适 量 的 FAM-siRNA 储备液，用 DEPC 水溶液分别配置系列浓度的FAM-siRNA标准溶液。采用荧光分光光度法，选择激发波长（Ex）为 480 nm、发射波长（Em）为 520 nm，测定各浓度 FAM-siRNA 标准溶液的荧光强度 F，并绘制荧光强度 F-浓度 C 标准曲线。取高、中、低浓度的 FAM-siRNA 标准溶液各 5份，测定日内和日间精密度。取适量空白胶束和Res 混合溶液，加入适量 FAM-siRNA 标准溶液，测定并计算回收率。上述实验均重复 3 次。2.3 Res 包封率和载药量测定 采用超速离心法分离 游 离 Res，测 定 MCpH/RedoxRes-siRNA 的包封率（EE%）和载药量(DL%)。取适量 MCpH/RedoxRes-siRNA 溶液，于 12 000 rpm 离心 10 min 后，取上清液，过 0.22 m 微孔滤膜。精密吸取该溶液 1.0 mL 置于 10 mL 容量瓶中，加甲醇定容后，按建立的“2.1 Res 体外分析方法”测定吸光度值 A，计算 Res 浓度，计算得 MCpH/RedoxRes-siRNA 中 Res 的 量。另 取 1.0 mL MCpH/RedoxRes-siRNA 溶 液，置 于 10 mL 容量瓶中，加入甲醇定容，测定吸光度值 A，带入标准曲线计算 Res 浓度，得 MCpH/RedoxRes-siRNA 中 Res 的总量，上述实验均重复 3 次。其中：Wtotal 是制备时加入 Res 的量，WRes和 Wcopolymer 分别为胶束复合物中 Res 和共聚物材料的量。2.4 FAM-siRNA 包封率测定 采用超滤离心法测定MCpH/RedoxRes-siRNA中siRNA的包封率。精密吸取 1.0 mL MCpH/RedoxRes-siRNA，加至3第35卷 第2期2023年VOL.35NO.22023菏 泽 医 学 专 科 学 校 学 报JOURNALOFHEZEMEDICALCOLLEGEAmicon Ultra-4 超滤管（NMWL=30 kD）中，于6 000 rpm 离心 10 min。精密吸取 0.5 mL 管套中所得的滤液，用DEPC水定容至10 mL，按建立的“2.2 FAM-siRNA 体外分析方法”，测定荧光强度 F，并代入标准曲线中计算游离 FAM-siRNA 浓度。按下述公式计算FAM-siRNA包封率（Encapsulation Efficiency，EE%）。上述实验均重复 3 次。其中：ntotal 为加入 FAM-siRNA 总量，nfree为未包裹入胶束复合物 FAM-siRNA 量。2.5 不同 pH 及还原条件下胶束复合物的药物触发 释 放 行 为5 取 MCpH/RedoxRes-siRNA 溶液 2.0 mL，置于截留分子量为 30 000 的透析袋中。采用溶出度测定仪，将透析袋固定在桨上，分别置于 pH 7.4、pH 5.5、pH 7.4+20 mM DTT 和pH 5.5+20 mM DTT 的透析介质中（PBS 缓冲溶液，200 mL，370.5），设置转速 1 000 rpm，按照事先设定的时间点取样，同时补充相同温度和体积的新鲜透析介质。按照 Res 体外分析方法和 FAM-siRNA 体外分析方法测定样品中 Res 和FAM siRNA 的含量，计算 24 h 药物累计释放量，并绘制累计释放曲线，上述实验均重复 3 次。2.6 统计学处理 采用 Excel 软件对数据进行处理和统计学分析，数据均用xs表示。3结果3.1 Res 体外分析方法的建立 Res 的体外分析标准