侧柏古树组织培养体系的建立.pdf

DOI:10.12403/j.1001-1498.20220498侧柏古树组织培养体系的建立常二梅1，江泽平 1，刘建锋1，贾子瑞1，李香2，张健强3，赵秀莲1*(1.林木遗传育种全国重点实验室，国家林业和草原局林木培育重点实验室，中国林业科学研究院林业研究所，北京100091；2.北京市绿地养护管理事务中心，北京102211；3.邯郸市林业工程项目中心，河北邯郸057650)摘要：目的 攻克侧柏古树在组织培养中外植体消毒不彻底、褐化严重、分生能力弱等技术难点，建立侧柏古树的组织培养体系。方法 以树龄约 3000 年侧柏古树当年生的新梢为外植体，经过消毒灭菌处理获得无菌外植体。通过筛选适宜的培养基和激素，建立侧柏古树组织培养体系。结果 外植体用 0.3%HgCl2消毒 10min 的灭菌效果最好，污染率为 25.81%，成活率为 54.82%。侧柏古树组织培养基的糖源用 3%蔗糖的效果比 3%葡萄糖更佳。抗氧化剂与吸附剂试验结果表明，在外植体启动培养基中加入 3.00gL1活性碳，外植体褐化率最低。侧柏古树组织培养的最佳初代培养基为：1/2MS+NAA0.2mgL1+6-BA0.1mgL1，不定芽诱导率为 32.05%，芽生长快，嫩绿且粗壮。最佳的增殖培养基为：1/2MS+6-BA0.05mgL1+NAA0.2mgL1+KT0.1mgL1，增殖系数为 1.93，绿色芽生长快且粗壮。最佳的生根培养基为：WPM+NAA0.5mgL1+IBA0.5mgL1，生根率达到 9.12%，每株平均生根数为 2.67，平均根长为 1.23cm。总共获得24 株 生 根 苗，2 个 月 后 2 株 有 红 根 出 现，嫩 芽 继 续 生 长，成 功 获 得 侧 柏 古 树 组 织 培 养 生 根 苗。结论 侧柏古树培养基的选择、生长素与细胞分裂素的比例是侧柏古树增殖培养和不定根形成的重要因素，此实验为其他柏科树木组织培养提供了参考。关键词：侧柏；古树；组织培养；褐化；生根中图分类号：S722.43文献标识码：A文章编号：1001-1498(2023)04-0041-09侧柏（Platycladus orientalisL.）具有抗逆和长寿等优良特性1。陕西省黄帝陵树龄约 3000年的侧柏古树（黄帝手植柏）为中华十大手植古树之首，具有重要的文化价值2-4，其繁殖材料极其珍贵又极度匮乏，因此，能利用较少的繁殖材料的组织培养技术对于保存侧柏古树的种质资源至关重要5-6。目前，国内已经建立了一些古树，如杜鹃（Rhododendron simsii Planch.）、楸 树（Catalpa bungei C.A.Mey.）、西 府 海 棠（Malus micromalusMakino）等的组织培养体系7-9；但大部分的古树，如柿树（DiospyroskakiThunb.）、侧柏等的组织培养繁殖困难，存在愈伤组织褐化、生根难、组织培养体系不完整等问题10。国外在建立古树组织培养体系方面也有一定的研究，Ewald 等利用 140 年生欧洲落叶松（Larix deciduaMill.）嫁接复幼后的新梢为外植体进行组织培养获得了生根苗，但直接利用古树外植体进行组织培养并没有获得生根苗11。因此，对古树的外植体组织培养体系的研究尤为重要。目前，国内已经有了一些柏科树木组织培养的相关研究12-17，如臭柏（Sabina vulgarisAnt.）、龙柏（Sabina chinensisL.）等；但组织培养过程中，外植体真菌、细菌聚集，灭菌不彻底，褐化严重等问题仍然存在，对后期外植体的正常生长造成阻碍15。NaClO、双氧水、75%乙醇、HgCl2等是 常 用 的 消 毒 和 灭 菌 剂，如 用 75%酒 精 和HgCl2配合使用对叉子圆柏（Juniperus sabinaL.）的外植体灭菌效果较好15-16，适合的灭菌剂和收稿日期：2022-11-11修回日期：2023-01-18基金项目：“十四五”国家重点研发计划课题（2022YFD2200103）；国家自然科学基金面上项目（31870664）；河北省林业和草原局科学技术研究项目“邯郸市古树名木资源调查和复壮技术研究（2001029）”*通讯作者:赵秀莲，博士，助理研究员，生态学。电话：01062888668。E-mail：Z林业科学研究2023，36（4）：41-49Forest Researchhttp:/灭菌时间是组织培养需要解决的首要问题。在防止褐化方面，大果柏木(Cupressus macrocarpaHartw.)培养基中加入聚乙烯基吡咯烷酮18、黄扁柏（Chamaecyparis nootkatensisSpach.）培养基中加入抗坏血酸能有效防止褐化19；但是酸刺柏（Juniperus oxycedrusL.）的培养基中加入活性炭后生根率降低20，因此，对柏科树木组织培养抗褐化配方还需要进一步研究。柏科古树随着年龄的增长，细胞逐渐衰老，枝条次生代谢物质多、营养物质（可溶性糖、可溶性蛋白）和生长相关激素等含量降低，从而导致枝条分裂能力降低5-6。如酸刺柏以糖原为 4%蔗糖的培养基上生根率较高21。激素种类如：IAA、IBA和 KT 等显著影响柏科树木外植体的分化和生长15，NAA 和 BA 的配合使用能诱导更多的腓尼基桧（Juniperus phoeniceaL.）丛生芽22，ZT 能较好的诱导日本香柏（Thuja occidentalisL.）茎的丛生芽23。因此，筛选合适的糖源和激素在组织培养过程中很关键。许多植物在组织培养中能获得增殖的幼苗却很难获得生根苗，生根培养也是柏科植物组织培养的瓶颈8，侧柏古树筛选的生根培养基主要有 MS 和WPM 为基本培养基5。绒柏（Chamaecyparispisiferacv.Squarros）和山达脂柏（Tetraclinisarticulata(Vahl.)Masters）的生根培养基分别为SH、MS13,24。前人对侧柏古树的组织培养过程中只获得新芽的增殖配方，却没有获得生根苗。本研究以侧柏古树新梢为外植体，通过改变外植体消毒处理方式、抗褐化剂、不同碳源和植物生长调节剂的种类及浓度配比，探索培养黄帝手植柏无菌苗的适宜条件，旨在为保存侧柏古树的优良种质资源提供参考依据。1材料与方法1.1材料外植体选择生长季采自陕西黄帝陵的树龄约 3000 年侧柏古树（黄帝手植柏）生长健壮、无病虫害的新梢，用装有冰块的保温箱当日带回实验室进行组织培养。每个处理设 3 个重复，每个重复20 个外植体。1.2试验方法1.2.1建立侧柏古树外植体无菌体系首先将采回的新梢用 5%NaClO 表面消毒5min，用自来水冲洗 5 遍；再用洗涤灵浸泡 5min，用自来水流水冲洗 2h，接着用无菌水将嫩枝在超净工作台里反复冲洗 5 遍；用 75%的酒精浸泡30s，再用无菌水冲洗 5 遍；最后使用 0.3%HgCl2消毒，消毒时间分别为 6、8、10、12min，再用无菌水冲洗5 遍。吸干水分，剪掉下端与消毒剂接触的部分后用于下一步实验。30d 后对污染率（Pollutionrate，rp）、死亡率（Mortalityrate，rm）和成活率（Survivalrate，rs）进行统计。rp=(np/N)100%(1)rm=(nm/N)100%(2)rs=(ns/N)100%(3)式中：np为污染个数，nm为死亡个数，ns为成活个数，N 为接种个数。1.2.2不同种类糖源对侧柏古树外植体组织培养的影响在侧柏古树外植体初代培养基中分别添加 3%葡萄糖和 3%蔗糖，比较不同糖源对侧柏古树外植体褐化的影响。1.2.3不同防褐化剂对侧柏古树外植体褐化的影响侧柏古树外植体的培养基中分别添加质量浓度为：0、1.00、3.00、5.00gL1的活性炭、抗坏血酸和聚乙烯吡咯烷酮，对比它们抑制褐化的效果，并在接种 14d 后统计侧柏古树外植体的褐化率（Browningrate，rb)。rb=(nb/N)100%(4)式中：nb为褐化个数，N 为接种个数。1.2.4侧柏古树最佳初代培养筛选侧柏古树选择 1/2MS 为初代培养基，分别添加 6-BA（浓度分别 为：0.05、0.10、0.50 mgL1）、NAA（浓度分别为：0.05、0.10、0.20mgL1）和 3.00mgL1的活性碳。侧柏古树新梢剪成 23cm 的小段进行接种，增殖培养 45d 后统计不定芽诱导率（Adventitiousbudinductivityrate，rabi）、平均生长量及生长情况等。rabi=(nabi/N)100%(5)式中：nabi为不定芽个数，N 为接种个数。1.2.5侧柏古树最佳增殖培养筛选增殖培养的目的是在短时间内得到大量适合生根的嫩芽，将初代培养基上培养的组织培养苗的萌芽切成小段进行增殖培养。1/2MS 增殖培养基中添加 6-BA（浓度分别为：0.02、0.05、0.10mgL1）、KT（浓度42林业科学研究第36卷分 别 为：0.05、0.10、0.20 mgL1）、NAA（浓度分别为：0.05、0.10、0.20mgL1），培养 45d 后分别统计增殖系数、平均生长量及生长情况等。1.2.6侧柏古树最佳生根培养筛选把增殖培养的组织培养苗分别放入 1/2MS、WPM、DKW 基本培养基中，培养 30d 后统计生根率及生根情况。选用激素 NAA（浓度分别为：0、0.20、0.50、1.00mgL1）和 IBA（浓度分别为：0.50、1.00、1.50mgL1）。培养 40d 后统计生根率（Rootingrate，rr）及生根情况。rr=(nr/N)100%(6)式中：nr为生根个数，N 为接种个数。1.2.7炼苗及试管苗移植生根苗是否能适应外界环境是移植的关键。移植前 3d 将生根苗瓶盖打开。移植当天用镊子将小苗取出，并洗掉根上附着的培养基，移植入基质（草炭土:蛭石:珍珠岩=1:1:1）后浇水，将生根苗置于培养箱内培养，每天观察小苗的生长状况，计算炼苗死亡率（Mortalityrateoftrainingseedlings，rmts）。rmts=(nmts/Nts)100%(7)式中：nmts 为死亡的组织培养苗数，Nts为炼苗的组织培养苗数。2结果与分析2.1消毒时长对侧柏古树外植体消毒效果的影响表 1 表明：侧柏古树组织培养过程消毒时间过长或过短对组织培养都不利，0.3%HgCl2消毒 6min 处理的组织培养苗污染率最高（图 1A）；当处理消毒 12min 时，组织培养苗污染率虽然最低，但是成活率也最低（31.22%）；消毒 8、10min的组织培养苗成活率高于其他处理，成活率分别为 54.82%和 54.98%。因此，消毒处理 10min较适合侧柏古树组织培养。表1消毒时长对侧柏古树外植体消毒效果的影响Table1EffectofdifferentsterilizingtimeonsterilizingeffectofancientPlatycladusorientalis消毒时间Timeofsterilization/min污染率rc/%死亡率rd/%成活率rs/%640.0010.31a16.722.68c43.345.94ab825.815.89b19.453.58b54.828.71a1024.555.26b20.644.19b54.9810.87a1224.214.62b44.887.52a31.224.92b注：同列不同小写字母代表处理间差异显著（P0.05)；数值为平均值标准差；下同。Notes:DatawerepresentedasmeansSD.Differentlowercaselettersinthesamecolumnrepresentsignificantdifferenceat0.05level.Thesameasbelow.AEFGBCD注：A.外植体褐化；B.活性炭处理；C.初代培养；D.增殖培养；E、F.组培苗生根情况；G.生根苗移植Notes：A.Thebr