苯乳酸对单增李斯特菌生物被膜的影响.pdf

姜聪一，康瑞，于涛，等.苯乳酸对单增李斯特菌生物被膜的影响 J.食品工业科技，2023，44（18）：164172.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022100239JIANG Congyi,KANG Rui,YU Tao,et al.Effects of Phenyllactic Acid on Listeria monocytogenes BiofilmsJ.Science andTechnology of Food Industry,2023,44(18):164172.(in Chinese with English abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022100239 生物工程 苯乳酸对单增李斯特菌生物被膜的影响苯乳酸对单增李斯特菌生物被膜的影响姜聪一1，康瑞1，于涛2，姜晓冰1,*（1.河南师范大学生命科学学院，河南新乡 453007；2.新乡学院生命科学与基础医学学院，河南新乡 453000）摘要：为研究苯乳酸（Phenyllactic Acid，PLA）对单增李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）生物被膜的影响，采用结晶紫法检测 Lm 生物被膜生物量、倒置显微镜和扫描电镜观察 Lm 生物被膜结构；分别采用苯酚硫酸法、福林酚法和二苯胺法测定生物被膜中胞外多糖、胞外蛋白和胞外 DNA 的含量；利用实时荧光定量 PCR 检测PLA 对 Lm 生物被膜形成相关基因转录水平的影响。结果表明：PLA 对 8 株 Lm 菌株的最小抑菌浓度值均为 6 mg/mL。PLA 通过抑制胞外多糖和胞外蛋白的合成抑制 Lm 生物被膜的形成。对于 Lm 成熟生物被膜，PLA 通过减少胞外多糖和胞外蛋白的量破坏生物被膜结构、降低生物被膜生物量。PLA 还能抑制 Lm 的运动性。在 PLA 作用下Lm 群体感应系统 agr 的转录水平显著（P0.05）降低。作为一种天然抗菌物质，PLA 在控制 Lm 及其生物被膜对食品污染方面具有潜在的应用价值。关键词：单增李斯特菌，苯乳酸，生物被膜，胞外多聚物本文网刊:中图分类号：Q93-33 文献标识码：A 文章编号：10020306（2023）18016409DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022100239EffectsofPhenyllacticAcidonListeriamonocytogenesBiofilmsJIANGCongyi1，KANGRui1，YUTao2，JIANGXiaobing1,*（1.College of Life Sciences,Henan Normal University,Xinxiang 453007,China；2.School of Life Sciences&Basic Medicine,Xinxiang University,Xinxiang 453000,China）Abstract：To investigate the effect of phenyllactic acid(PLA)on Listeria monocytogenes biofilms,crystal violet methodwas used to measure the biomass of L.monocytogenes biofilms,and inverted microscope and scanning electron microscopewere used to observe the structure of L.monocytogenes biofilms,the content of extracellular polysaccharide,extracellularprotein and extracellular DNA in biofilm was measured by phenol-sulfuric acid method,Folin-phenol method anddiphenylamine method,respectively.The effect of PLA on the transcription of genes associated with biofilm formation ofL.monocytogenes was detected by real-time quantitative PCR.The results showed that the minimum inhibitoryconcentration values of PLA against eight L.monocytogenes strains were 6 mg/mL.PLA inhibited L.monocytogenesbiofilm formation by reducing the synthesis of extracellular polysaccharides and extracellular proteins.For mature biofilmsof L.monocytogenes,PLA destroyed the biofilm structure and reduced the biofilm biomass by reducing the amount ofextracellular polysaccharides and extracellular proteins.PLA also inhibited the swarming motility of L.monocytogenes.Thetranscription levels of quorum sensing system agr in L.monocytogenes were significantly (P0.05)decreased in thepresence of PLA.As a natural antimicrobial compound,PLA had the potential application to control food contamination byL.monocytogenes and its biofilms.Keywords：Listeria monocytogenes；phenyllactic acid；biofilm；extracellular polymeric substances 单增李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）是一种重要的食源性致病菌，在自然界中广泛存在。该菌能够引起人畜共患病李斯特菌病，典型的临床症状表现为脑膜炎、败血症、流产等1。李斯特菌病 收稿日期：20221024 基金项目：河南省自然科学基金（222300420470）；河南省高等学校重点科研项目基础研究计划（222300420470）；河南师范大学国家级科研项目培育基金（20200148）。作者简介：姜聪一（1997），女，硕士研究生，研究方向：食品微生物的污染与控制，E-mail：。*通信作者：姜晓冰（1984），女，博士，副教授，研究方向：食品微生物污染与控制，E-mail：。第 44 卷 第 18 期食品工业科技Vol.44 No.182023 年 9 月Science and Technology of Food IndustrySep.2023 的发病率不高，但是致死率可高达 33%，严重威胁人类身体健康2。大量研究表明，食用被 Lm 污染的食品是造成李斯特菌病散发和爆发流行的主要原因3。Lm 可粘附在食品接触表面形成生物被膜，被膜态的Lm 能够在食品加工环境中存活数月乃至数年之久4。被膜态 Lm 分泌的胞外聚合物主要由胞外多糖、胞外蛋白和胞外 DNA 组成，这些胞外物质可形成物理屏障，阻碍抗菌药物向被膜内扩散，提高Lm 在不利环境中的存活能力56。Lm 生物被膜是一种潜在的污染源，可能引起食品交叉污染和加工后污染，威胁食品安全7。因此，寻找能够有效抑制Lm 及其生物被膜的抗菌物质对预防和控制 Lm 引起的食源性疾病显得尤为重要。苯乳酸（Phenyllactic acid，PLA）广泛存在于许多植物和食品中，如雪莲、天麻、蜂蜜、乳酸菌发酵食品等89。PLA 抗菌谱广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及真菌均表现出良好的抗菌活性1012。研究发现 PLA 作用后细菌细胞壁结构被破坏，胞内成分泄漏，表明细胞壁可能是 PLA 的作用靶点之一。PLA 还能通过与细菌基因组 DNA 结合阻止 DNA复制从而干扰细胞正常功能1315。PLA 具有水溶性好、理化性质稳定、安全性高等优点，在食品工业中具有广阔的应用前景1617。目前的研究主要集中在 PLA 对浮游态细菌的抑菌活性和抑菌机制方面8,1315，而关于 PLA 对细菌生物被膜抑制效果的研究相对较少。本文主要研究PLA 对 Lm 生物被膜形成的抑制及成熟生物被膜的清除效果，通过检测生物被膜胞外聚合物的含量、Lm 运动性以及生物被膜相关基因转录水平初步探究 PLA 对 Lm 生物被膜的作用机制，为 PLA 在控制 Lm 及其生物被膜方面的应用奠定理论基础。1材料与方法 1.1材料与仪器Lm 标准菌株 EGD-e 和 10403S由华中师范大学罗勤教授惠赠，Lm 食品分离株 L1、L44、L46、L60、L69 和 L82 由本实验室保存，菌株信息见表 1；脑心浸液培养基（Brain Heart Infusion，BHI）OXOID；PALCAM 琼脂青岛高科园海博生物技术有限公司；草酸铵山东豪顺化工有限公司；结晶紫天津市大茂化学试剂厂；无水乙醇天津富宇精化工有限公司；戊二醛上海麦克林生化科技有限公司；叔丁醇天津市大茂化学试剂厂；苯酚济南鑫沃化学有限公司；胰蛋白胨大豆肉汤培养基（Tryptic SoyBroth，TSB）青岛高科园海博生物技术有限公司；福林酚北京索莱宝科技有限公司；小牛胸腺 DNA上海麦克林生化科技有限公司；RealMaster Mix（SYBR Green）试剂盒天根生化科技（北京）有限公司；细菌 RNA 提取试剂盒上海碧云天生物技术有限公司；荧光定量 PCR 试剂盒北京天根生化科技有限公司。表 1 菌株信息Table 1 Strain information菌株来源血清型EGD-e动物1/2a10403S人1/2aL1生猪肉1/2cL44生鸡肉1/2cL46速冻米面制品4bL60生猪肉1/2cL69速冻米面制品4bL82速冻米面制品1/2a JSM-6390LV 场发射扫描式电子显微镜（FieldEmission Scanning Electron Microscopy，FE-SEM）日本株式会社日立高新技术公司；DMi1 倒置显微镜Leica 公司；LightCycle96 实时荧光定量 PCR 仪ABI 公司；Synergy H1 酶标仪美国安捷伦 BioTek 公司；SW-CJ-2FD 超净工作台苏州安泰空气技术有限公司；HZQ-X300C 恒温振荡器上海一恒科学仪器有限公司；LHS-800C 生化恒温培养箱上海力辰仪器科技有限公司；JIDI-20R 冷冻离心机广州吉迪仪器有限公司。1.2实验方法 1.2.1 最小抑菌浓度（Minimal Inhibitory Concentra-tion，MIC）的测定采用琼脂稀释法检测 PLA 对Lm 菌株的 MIC 值18。以无菌去离子水为溶剂配制为 20 mg/mL 的 PLA 母液。配制含有不同浓度 PLA（终浓度分别为 0、2、4、6 和 8 mg/mL）的 BHI 平板，取 1 L（稀释比例为 1:5）稀释后的菌液接种至 BHI平板，37 培养 2 d。1.2.2 PLA 对 Lm 生物被膜形成的影响 1.2.2.1 结晶紫法采用结晶紫染色法测定 PLA 对8 株菌生物