薄壳山核桃花粉活力测定方法比较.pdf

Vol.41 No.2Jun.2023第 41 卷 第 2 期2023 年 6 月经 济 林 研 究 Non-wood Forest Research收稿日期：2022-10-18基金项目：中央财政林业科技推广示范资金项目（苏2022TG04）；江苏省高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）。第一作者：刘帅（），硕士研究生。通信作者：彭方仁（），教授，博士，博士研究生导师。引文格式：刘帅,彭方仁.薄壳山核桃花粉活力测定方法比较 J.经济林研究,2023,41(2):110-119.LIU S,PENG F R.Comparison of detection methods for pollen viability of Carya illinoinensisJ.Non-wood Forest Research,2023,41(2):110-119.薄壳山核桃花粉活力测定方法比较刘 帅，彭方仁（南京林业大学 a.南方现代林业协同创新中心；b.林学院，江苏 南京 210037）摘 要：【目的】筛选并优化薄壳山核桃花粉活力的测定方法，为薄壳山核桃的杂交育种提供参考。【方法】以 韦科、苏普锐尔、基奥瓦、奥多姆 4 个薄壳山核桃品种的花粉为试验材料，分别采用 MTT 染色法、TTC 染色法、过氧化物酶染色法、醋酸洋红染色法、I2-KI 染色法和蓝墨水染色法对花粉进行染色，比较不同染色方法及不同染色溶液浓度处理间花粉活力的差异。采用正交试验对薄壳山核桃花粉萌发培养基配方进行优化，筛选适合薄壳山核桃花粉萌发的培养基。通过回归分析，探讨花粉染色率和离体萌发率之间的相关性，寻找最适合测定薄壳山核桃花粉活力的染色方法。【结果】除 TTC 染色法外，其余方法均能使薄壳山核桃花粉染色。适宜 4 个 薄壳山核桃品种花粉萌发的培养基并不完全相同，适宜韦科、基奥瓦和奥多姆花粉萌发的培养基为 5%蔗糖0.01%硼酸 0.05%硝酸钙 25%PEG-4000，萌发率分别可达 36.80%、46.32%、59.51%。适宜苏普锐尔花粉萌发的培养基为 8%蔗糖 0.025%硼酸 0.025%硝酸钙 25%PEG-4000，萌发率为 24.19%。采用 MTT 染色法所染深色花粉比例接近花粉萌发率，且所测花粉活力与花粉萌发率呈线性正相关（R2 0.686，P 0.001）。【结论】薄壳山核桃不同品种的最适花粉萌发培养基组分有差异，与其他染色法相比，MTT 法更适用于薄壳山核桃花粉活力的快速检测。关键词：薄壳山核桃；花粉活力；萌发率；MTT中图分类号：S664.1 文献标志码：A 文章编号：10038981(2023)02011010Comparison of detection methods for pollen viability of Carya illinoinensisLIU Shuai,PENG Fangren(a.Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China;b.College of Forestry,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,Jiangsu,China)Abstract:【Objective】In order to screen and optimize the determination method of the pollen viability of pecan,provide a reference for the cross breeding of pecan.【Method】The pollen of four pecan cultivars,Waco,Superior,Kiowa,and Odom,were used as test materials,the pollen was stained with 2,5-diphenylmonotetrazolium bromide(MTT),2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride(TTC),peroxide,acetic carmine,I2-KI and blue ink dyeing methods,respectively,the differences in pollen viability between different staining methods and different stain concentrations were compared.The orthogonal test was used to optimize the pecan pollen germination medium formulation and to screen the medium suitable for pecan pollen germination.Through regression analysis,the correlation between pollen staining rate and in vitro germination rate was explored,so as to find the most suitable staining method for measuring the pollen viability of pecan.【Result】Except for TTC dyeing method,other methods could dye pecan pollen.The media suitable for pollen germination of the four pecan cultivars were not identical.The suitable media for pollen of Waco,Kiowa and Odom were:5%sucrose+0.01%boric acid+0.05%calcium nitrate+25%PEG-4000 and the germination rates were 36.80%,46.32%and 59.51%,respectively.The suitable medium for Superior pollen was 8%sucrose+0.025%boric acid+0.025%calcium nitrate+25%PEG-4000,and the germination rate was 24.19%.The proportion of dark Doi:10.14067/ki.1003-8981.2023.02.012http:/111第 41 卷经 济 林 研 究薄壳山核桃Carya illinoinensis又名长山核桃，属胡桃科 Juglandaceae 山核桃属 Carya，是世界著名的干果油料树种，也是优良的材用和庭园绿化树种，具有较高的经济价值，因此被世界各地广泛引种1-3。19 世纪末我国开始引种薄壳山核桃，但至今未形成规模化种植4-5。花粉作为植物遗传的载体，是杂交育种的基础6。花粉活力直接影响到有性生殖的效率与能力。因此，在杂交育种前对花粉活力进行准确且快速的检测十分重要7。花粉活力的测定方法主要有染色法和离体萌发法。离体萌发法稳定可靠，然而该方法受到体外培养条件的限制，例如培养基的组成（蔗糖、钙和硼酸等）和环境因素（温度和湿度等），此外不同的植物以及不同品种需要不同的培养条件。染色法快速简便，但同种花粉采用不同染色法获得的结果有较大差别8-9。薄壳山核桃为雌雄异花植物，存在雌雄异熟现象，雌花的可授粉期与雄花的散粉期大多不一致，而环境条件的变化也会影响薄壳山核桃的花期，从而导致授粉困难10-11。掌握薄壳山核桃的花粉特性，是科学授粉及育种的重要依据。目前，测定薄壳山核桃花粉活力的方法有离体萌发法12、MTT 染色法13、FCR 荧光染色法14等，但关于不同花粉活力测定方法的系统比较及优化研究鲜有报道。因此，开展花粉离体萌发培养并确定适宜的花粉活力测定方法，对开展薄壳山核桃育种研究具有重要意义。本研究中采用不同方法测定了薄壳山核桃花粉活力，探究适合测定薄壳山核桃花粉活力的染色方法，筛选花粉萌发最适培养基，并探讨了花粉染色率与萌发率的相关性，旨在为薄壳山核桃的杂交育种提供参考。1 材料与方法1.1 试验材料在江苏省句容市南京林业大学薄壳山核桃试验基地，以韦科（Waco）、苏普锐尔（Surprise）、基奥瓦（Kiowa）、奥多姆（Odom）4 个薄壳山核桃品种为花粉采集对象。于薄壳山核桃雄花散粉期采集雄花序，将花序平摊在硫酸纸上，放置于阴凉通风处 24 h，待其自然散粉，过筛（筛网孔径 0.125 mm）并收集花粉，放入装有变色硅胶的自封袋中，放置于-20 冰箱中，备用。在保存后 20 d 内完成各品种花粉活力的测定。1.2 试验方法1.2.1 花粉染色使用 MTT 染色法15、TTC 染色法16、过氧化物酶染色法17、醋酸洋红染色法18、I2-KI 染色法19、蓝墨水染色法20共 6 种染色方法来测定花粉的活力（表 1）。主要分为 3 个步骤。首先，配置不同的染色液；然后，在 1.5 mL 离心管中加入1 mL 染色液，用毛笔将花粉撒入离心管，染色；最后，将 1 滴（约 30 L）含有花粉和染色溶液的pollen stained by MTT staining was close to the pollen germination rate,and the measured pollen viability was linearly positively correlated with the pollen germination rate(R2 0.686,P 0.001).【Conclusion】The most suitable pollen germination medium for different varieties of pecans is different,MTT is more suitable for rapid detection of pollen viability of pecan compared with other methods.Keywords:Carya illinoinensis;pollen viability;germination rate;MTT表 1 使用的薄壳山核桃花粉染色方法Table 1 Methods to stain pecan pollen编号No.方法Method染色液及其配制方法Staining agent and preparation method染色时间Staining time/min染色温度Staining temperature/1MTT 染色法0.05 g MTT 溶于 10 mL 磷酸盐缓冲溶液30352TTC 染色法0.05 g TTC 溶于 10 mL 磷酸盐缓冲溶液30353过氧化物酶染色法试剂 A 为 0.5%联苯胺、0.5%-萘酚、0.25%碳酸钠各 10 mL混合均匀，试剂 B 为 0.3%过氧化氢，测试时将试剂 A 与试剂B 各 0.5 mL 混合均匀30354醋酸洋红染色法醋酸洋红染色液（Solarbio，北京）5255I2-KI 染色法1 g KI 和 0.5 g I2，溶于 200 mL 蒸馏水30356蓝墨水染色法20%蓝色墨水（Hero，上海）525112第 2 期刘 帅，等：薄壳山核桃花粉活力测定方法比较混合溶液滴至载玻片上，盖上盖玻片，使用奥林巴斯BX53显微镜（放大10倍）观察花粉染色情况。除蓝墨水染色法外，均以对应颜色花粉的染色率表示花粉活力（被染色的花粉数量占观察视野花粉总数的百分比），蓝墨水染色法所测花粉活力以未染色率表示。每种染