XapR蛋白在嗜水气单胞菌抗生素耐药性中的功能.pdf

第 37 卷第 2 期2023 年 6 月西昌学院学报（自然科学版）Journal of Xichang University（Natural Science Edition）Vol.37，No.2Jun.，2023XapR蛋白在嗜水气单胞菌抗生素耐药性中的功能傅钰瑛（福建船政交通职业学院安全与环境学院，福建 福州 350007）摘 要：研究嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）LysR型转录调节因子中XapR蛋白抗生素耐药的调控机制。通过测定嗜水气单胞菌ATCC 7966（野生型菌株）与嗜水气单胞菌ATCC 7966 xapR基因缺失株（xapR）对32种抗生素的最低抑菌浓度，系统地评价xapR基因抗生素耐药性；进一步利用定量蛋白质组学技术，探讨xapR参与嗜水气单胞菌调控的生物过程。结果表明：xapR基因缺失后细菌对头孢孟多的耐药性减弱；xapR基因可调控细菌碳代谢、TCA循环等多种代谢途径，此外还与外膜蛋白、TonB、ABC转运系统等抗性基因的表达密切相关。综上，XapR蛋白可通过调节细菌中心代谢途径以及多个抗性基因改变嗜水气单胞菌的耐药性。关键词：XapR；定量蛋白质组学；细菌耐药；嗜水气单胞菌；LTTRs中图分类号：Q936；S917.1 文献标志码：A 文章编号：16731891（2023）02000708The Function of XapR Protein in Antibiotic Resistance of Aeromonas HydrophilaFU Yuying（School of Safety and Environment，Fujian Chuanzheng Communications College，Fuzhou，Anhui 350007，China）Abstract:This paper studied the regulation mechanism on antibiotic resistance of LTTRs family protein XapR in Aeromonas hydrophila.The Minimum bactericidal concentration of Aeromonas hydrophila ATCC 7966(wild-type strain)and Aeromonas hydrophila ATCC 7966 xapR gene deletion strain（xapR）against 32 antibiotics were measured to evaluate the antibiotic resistance.Further，quantitative proteomics were used to investigate the effect of xapR deletion on the protein expression of Aeromonas hydrophila.The results showed that by contrast with wild-type strains in terms of antibiotics resistance，the minimum bactericidal concentration of cefamandole reduced by 2 times in xapR.Subsequently，omics analysis showed that xapR could regulate bacterial carbon metabolism，TCA cycle and other pathways，and also closely related to the expressions of outer membrane protein，TonB，and ABC transport system.In conclusion，XapR can change the drug resistance of Aeromonas hydrophila by regulating the central metabolic pathway and multiple resistance genes.Keywords:XapR；quantitative proteomics；bacterial resistance；Aeromonas hydrophila；LTTRs0 引言LysR 型 转 录 调 节 因 子（LysR-type transcriptional regulators，LTTRs）是家族成员数量最多的转录调控因子，普遍存在于原核生物中1。其作为全局转录调节因子参与调节编码多种功能蛋白质基因的转录，尤其在细菌抗生素耐药的调控中发挥重要作用2。Srinivasan 等3报道 LTTRs中 OxyR 蛋白正向调控RND外排泵基因acrB，导致克雷伯氏肺炎菌对氯霉素、红霉素、萘腚酸和甲氧苄啶耐药。XapR属于LTTRs家族蛋白，参与黄嘌呤核苷的分解代谢。包括大肠杆菌在内的很多细菌能够摄取外源嘌呤和嘧啶核苷，在嘌呤核苷磷酸化酶的作用下，分解为可被细菌吸收利用的氮源和碳源以维持自身的生长。近年来，对XapR的研究主要集中在黄嘌呤核苷的分解代谢领域4，而对于其他生物学功能的研究较少报道。嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是典型的人-畜-鱼共患的条件致病菌，可感染各种鱼类、蟹、蛙和贝壳类等水产品，出现细菌性败血症、溶血性doi：10.16104/j.issn.16731891.2023.02.002收稿日期：2023-01-13基金项目：福建船政交通职业学院博士科研启动专项基金（20220105）。作者简介：傅钰瑛（1989），女，福建仙游人，讲师，博士，主要研究方向：病原微生物耐药与致病机制。西昌学院学报（自然科学版）第 37 卷腹水病等疾病，最终造成巨大的经济损失5。经氨基酸序列比对分析预测，发现嗜水气单胞菌的XapR蛋白属于LTTRs，目前关于其蛋白功能的研究鲜少报道。课题组前期曾利用分子生物学和蛋白质组学技术，发现嗜水气单胞菌LTTRs家族蛋白YeeY、AHA_1656、AHA_1798和AHA_3753在细菌耐药中发挥重要作用，因XapR属于LTTRs家族蛋白，这提示xapR基因也可能参与嗜水气单胞菌细菌耐药性的调控6-7。因此本论文拟构建嗜水气单胞菌xapR基因缺失株，分析该基因缺失后细菌抗生素耐药性的变化，接着通过定量蛋白质组学技术分析xapR基因缺失株与野生型菌株差异蛋白的表达，并通过生物信息学分析初步揭示其耐药机制。1 材料与方法1.1 材料、试剂及仪器1）菌株及培养条件：嗜水气单胞菌ATCC 7966（野生型菌株）、嗜水气单胞菌ATCC 7966 xapR基因缺失株（xapR）均来自福建农林大学林向民教授实验室，该菌以LB培养基为营养介质，最适宜的生长温度为30。2）主要试剂：本试验用到的抗生素信息如表1所示。胰蛋白胨、酵母粉、琼脂粉均购自上海翊圣生物科技有限公司；硫脲、二硫苏糖醇、碘乙酰胺购自Sigma（St.Louis，MO）；蛋白RpoZ和A0KQS2一抗为实验室制备的多克隆抗体；山羊抗小鼠二抗购自康为世纪生物科技股份有限公司。3）主要仪器：单人单面净化工作台（SW-CJ-1FD型，苏州净化设备有限公司）；PCR仪（T100TM，BIO-RAD）；生化培养箱（SPX-60BSH-，上海精宏实验设备有限公司）；化学发光凝胶成像仪（Fluorchem FC3，ProteinSimple）；全自动生长曲线分析仪（FP-1100-C，Bioscreen C）；核酸电泳仪（DYY-6D型，北京六一生物科技有限公司）；凝胶成像分析仪（Molecular Imager Gel Doc XR+，BIO-RAD）；高效液相色谱-质谱联用仪（Orbitrap Fusion Lumos Tribrid，Thermo Scientific）。1.2 野生型菌株和xapR生长速率的测定实验室一般采用紫外可见分光光度计等分析仪器测定 600 nm 波长处细菌培养液的吸光度（OD600）来确定细菌生长期。OD600是判定液体培养物中微生物生长的标准方法，本试验参照该方法并做稍微修改，具体如下：按照1%的比例分别转接野生型菌株和xapR的过夜菌至新鲜的LB培养基中，混匀，其中对照组为野生型菌株，接着按照每孔350 L体积的菌液分装至生长曲线分析仪的微孔板中，每个样品设置3次生物学重复，接着将其放入全自动生长曲线分析仪，设置温度30，每间隔1 h测定一次600 nm的吸光度值，共测定16 h，结束后导出数据并用Prism 8软件绘制生长曲线图谱。1.3 xapR抗生素耐药性评价首先采用琼脂平板 2倍稀释法测定细菌对 32种抗生素（表1）的最低抑菌质量浓度，接着筛选出有明显效果的抗生素通过稀释点板法进一步分析，从而评价细菌的耐药性8。琼脂平板二倍稀释法：配制含1.0 g/L琼脂的LB固体培养基，灭菌后稍做冷却，立即将配制好的抗生素母液按照一定的比例分别单独加入培养基中，摇匀后倒至培养皿吹干，每种抗生素设置 6个质量浓度梯度，测试范围如表 1所示，不添加抗生素的LB固体平板为对照组；接着各取2 L过夜菌液点在抗生素平板上吹干，30 培养24 h后观察并记录试验结果。稀释点板法：按照1%的比例转接过夜菌，加入适宜质量浓度的具有明效果的抗生素，对照组不做任何处理，将试验组和对照组同时置于30 200 r/min 摇床培养1 h后，10倍梯度稀释样品，然后各取2 L菌液接种于LB琼脂平板上，晾干后，30 培养 16 h，记录试验结果。1.4 野生型菌株和xapR全蛋白的质谱鉴定按照 1%的比例转接过夜菌至 20 mL 液体 LB中，于30 的恒温培养箱200 r/min培养至OD600约为 1.0 后，4 7 000 r/min 离心 15 min 弃上清，用 5 mL 预冷的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤菌体3遍；菌体悬于0.5 mL的细胞裂解液中，120 W，连续工作6 s，暂停9 s的程序进行超声破碎至溶液接近澄清，4 18 000 r/min 离心 15 min，收集上清，用 Broadfrod 试剂盒测定蛋白的浓度，参 照 FASP（filter-aided sample preparation）方法9进行酶解，操作步骤如下：取50 g蛋白样品，依次加入10 mmol/L二硫苏糖醇（Dithiothreitol，DTT），56 oC 孵育 40 min；500 mmol/L 吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA），室温避光静置30 min；然后按照1 50的质量比加入胰蛋白酶，37 酶解1618 h获得多肽样品，接着经 C18除盐小柱除盐后，进行质谱鉴定。质谱鉴定参照李碗芯等10的方法，依次使用数据依赖型采集和独立的数据采集 2种模式采集数据。首先，将多肽样品溶于 25 L A液（含 0.1%甲酸的水溶液），载入 5 L样品并以 4.5 L/min的流8第 2 期傅钰瑛：XapR蛋白在嗜水气单胞菌抗生素耐药性中的功能速流至EASY-nano-LC色谱系统的预柱上，然后以600 nL/min的流速过柱分离。色谱分离梯度为：018 min，B液（含0.1%甲酸的乙腈溶液）6%12%线性上升；1877 min，B液12%20%；77109 min，B液20%32%；109110 min，B液32%90%，之后90%B液维持到120 min。本次质谱仪的型号及参数设置如下：Orbitrap Fusion Lumos Tribrid（Thermo Scientific），离子源喷雾电压为2.0 kV，循环时间为3 s，一表1抗生素信息类型氨基糖苷类四环素类喹诺酮类头孢菌素类内酰胺类大环内酯类氯霉素类