靶向碱基切除修复途径以克服结直肠癌细胞中的阿霉素耐药性.pdf

第 卷第 期 年 月南京师大学报(自然科学版)()收稿日期:.基金项目:国家自然科学基金项目().通讯作者:何凌峰博士副教授研究方向:损伤修复.:.:./.靶向碱基切除修复途径以克服结直肠癌细胞中的阿霉素耐药性王源源印学晨董云菲刘 洁郭志刚何凌峰(南京师范大学生命科学学院江苏省分子与医学生物技术重点实验室江苏 南京)摘要 结直肠癌()具有非常高的发病率和死亡率成为全球第三大最常见的恶性肿瘤和第二大最致命的癌症.阿霉素作为化学治疗药物多年来一直广泛应用于癌症临床治疗但由于其耐药性和副作用治疗效果较为有限.已有研究证明在癌细胞中 修复能力会大大增强这在很大程度上会使得癌细胞在化学治疗药物引起的 损伤中存活下来.核酸内切酶()在各种类型的癌细胞中表达较高并在 损伤修复中起着关键作用.研究表明 抑制剂 显著增强了阿霉素的治疗效果这种联合治疗可以通过激活/通路进而抑制结直肠癌的细胞增殖故靶向 可为阿霉素在临床使用中提供一种新的策略.关键词 修复阿霉素结直肠癌肿瘤治疗中图分类号 文献标志码 文章编号()():().()./.:结直肠癌()历来是许多西方国家最常见的恶性肿瘤之一发病率和死亡率都很高而上消化道癌症则在东方国家占主导地位.然而在过去的几十年中许多亚洲国家的结直肠癌发病率也出现了迅速上升的趋势.手术切除仍然是结直肠癌最有效的手段之一化疗是治疗过程中最优选的辅助疗法之一.考虑到目前化疗疗效有限加用靶向药物已付诸实践.多柔比星也称为阿霉素自发现以来已普遍用于治疗多种形式的癌症.它属于蒽环类抗生素的化疗药物通过诱导 损伤来介导肿瘤细胞的死亡.阿霉素的确切作用机制很复杂目前尚不清楚但普遍认为阿霉素在临床相关浓度下的抗肿瘤作用主要是通过抑制拓扑异构酶 的进程进而导致双链 断裂().阿霉素因其广谱抗肿瘤作用被广泛用于癌症治疗在临床治疗中使用了多年但阿南京师大学报(自然科学版)第 卷第 期(年)霉素的治疗效果却非常有限这主要是由于癌细胞的耐药性和机体严重的不良反应.此外阿霉素的用途受到毒性的极大限制特别是对心肌的损害和危及生命的心脏损害这是累积且不可逆的阿霉素诱导的毒性和耐药性已被认为是化疗方法的主要障碍.研究表明毒性和耐药机制分别与活性氧的诱导和线粒体损伤有关.因此迫切需要探索克服耐药性和毒性的方法.细胞周期主要由细胞周期蛋白()及其相关的细胞周期蛋白依赖性激酶()复合物和抑制蛋白驱动.研究表明/通路在控制细胞生长方面发挥着关键作用该通路失调会导致不受控制的增殖这在各种癌细胞中可以观察到.家族成员可阻断由/和 产生的细胞周期进程.大量研究揭示了 蛋白在细胞衰老、细胞凋亡和 修复中的重要作用./蛋白是 细胞周期抑制剂家族的成员是一种肿瘤抑制剂可抑制/的活性并通过直接与 结合抑制其催化活性来促进 期阻滞./抑制剂、等相继获批.尽管有良好的临床效果但对于/抑制剂的内在或获得性耐药经常报道故制定各种策略来克服阻力非常重要.越来越多的报道证明 修复途径会使癌细胞在化疗药物诱导的 损伤中存活下来.故在癌症治疗中特定 修复途径的抑制剂与诱导 损伤的药物联合使用可能会行之有效.抑制剂在 缺陷型癌症中的成功应用凸显了 损伤修复()抑制剂的潜力.据报道 核酸内切酶()是碱基切除修复()和各种 修复途径中的关键成分.通过参与 复制和修复在维持基因组稳定性和完整性方面发挥重要作用并且在许多癌细胞中高表达.总之越来越多的研究已经表明抑制 蛋白对癌症的治疗非常重要.团队还成功开发了一种名为 的高效 抑制剂.基于上述这些报道猜测 抑制剂 可以使结直肠癌细胞对低剂量阿霉素治疗敏感.研究使用 细胞系作为研究模型并在体外和体内测试了这一想法.结果表明 和阿霉素的共同治疗有效地抑制了结直肠癌细胞的生长和促进了癌细胞的凋亡并且联合治疗显著激活了/通路.总之研究表明靶向 可能是阿霉素治疗结肠癌的潜在策略.材料与方法.主要试剂 培养基购自江苏凯基生物技术股份有限公司胎牛血清购自南京森贝伽生物科技有限公司胰蛋白酶()购自索莱宝生物科技公司阿霉素购自 ().抑制剂()是在自己的实验室中合成 如先前报道.本文使用的抗体:()()()()()()()()()().()购自南京恩晶生物科技有限公司()购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司极超敏 化学发光试剂盒()购自碧云天生物试剂公司细胞凋亡检测试剂盒(/)购自江苏凯基生物技术股份有限公司.主要方法.细胞培养本研究中所用的细胞株、和 均为本实验室保存.细胞培养使用 完全培养基并放置于 和 培养箱中培养用.的胰蛋白酶消化传代并于 传代一次.药物敏感性实验取 个/孔 和 细胞与不同浓度的阿霉素孵育或联合 /的 共孵育 处理的细胞作为对照.加药 后弃掉旧培养基将 的 和 的新鲜培养基混合添加到每个孔中并于 进一步孵育 在 处测量吸光度根据吸光度计算细胞相对数量.王源源等:靶向碱基切除修复途径以克服结直肠癌细胞中的阿霉素耐药性.蛋白印迹分析收集细胞用 轻轻洗涤 次用含有蛋白酶抑制剂的 裂解液充分裂解细胞经过细胞破碎仪和煮沸后使用 测定试剂盒对蛋白浓度进行定量.取 总蛋白样品进行 垂直电泳电泳结束后将蛋白转移至 膜上用 脱脂奶粉将膜封闭与一抗过夜孵育第二天孵育二抗使用 蛋白印迹检测试剂进行化学发光检测和拍照.克隆形成实验将 个/孔 细胞接种在 孔板中待贴壁后加相应的药物或抑制剂处理于 孵育约 周.然后将细胞用 洗涤 次并用.结晶紫溶液染色直至看到紫色清晰的克隆细胞团然后对六孔板进行拍照保存.核型分析实验加药处理之后的 细胞用秋水仙碱处理以将细胞停滞在中期然后于室温下细胞用低渗溶液孵育 用现配好的固定液(甲醇:醋酸)固定用吉姆萨溶液染色并在显微镜下扫描有丝分裂细胞.使用 .()检测图像并对每个中期细胞中的染色体进行计数和分析.免疫荧光将加药处理过后的 细胞按照 个/孔接种到 孔板中待爬片之后 洗涤 次用甲醛固定 加入 以通透细胞.载玻片用 封闭然后与一抗过夜孵育第二天孵育荧光二抗然后用 染色在荧光显微镜下观察.流式细胞术检测细胞凋亡将 个/孔 细胞接种在 孔板中待药物或抑制剂处理时间结束后收获所有细胞并根据制造商的方案使用凋亡检测试剂盒.简而言之用预冷的 洗涤细胞重悬于结合缓冲液中.然后细胞用 和碘化丙啶()染色室温避光孵育 流式细胞仪分析.阳性和 阴性染色的细胞计为坏死细胞.仅具有 阳性染色或同时具有 和 阳性染色的细胞被认为分别经历了早期或晚期细胞凋亡.具有 和 阴性染色的细胞被鉴定为正常.动物实验/裸鼠购自百奥赛图公司实验动物均饲养于南京师范大学实验动物中心(级).所有活体动物实验都得到了南京师范大学动物实验伦理委员会的批准().周龄/裸鼠右侧背部皮下注射 个 细胞.每 用卡尺测量肿瘤大小并根据二维测量计算肿瘤大小在肿瘤体积达到 时将小鼠随机分组阿霉素(/小鼠体重)和(/小鼠体重)腹膜内给药.肿瘤体积()计算为长度宽度/.在实验结束时处死小鼠分离并拍照肿瘤将皮下肿瘤组织用多聚甲醛固定一周后制成石蜡切片.免疫组化实验肿瘤组织离体后尽快放入 多聚甲醛中固定经梯度脱水后进行石蜡包埋和切片切片依次进行烘片二甲苯脱蜡、梯度酒精复水、通透及封闭内源性过氧化物酶、微波高温抗原修复、血清封闭、一抗孵育、二抗孵育、苏木素复染、梯度酒精脱水、中性树脂封片倒置荧光显微镜观察并拍照.统计分析所有试验均执行至少 次独立重复试验以获取具有统计学意义的实验数据.实验数据分析及作图使用 软件分析以()表示采用 检验的方法分析两组数据之间的差异多组间比较采用 方法进行统计分析.图片数据使用 软件和 软件进行处理分析并用 软件对数据进行统计分析.代表组别之间有显著性差异.结果与讨论.使结直肠癌细胞对阿霉素敏感研究表明 修复通路中的蛋白可以作为癌症治疗的靶点所以猜测 抑制剂 可以通过诱导 损伤使结肠癌细胞对化疗药物敏感.为了验证这一想法检测了 在结直肠癌细胞南京师大学报(自然科学版)第 卷第 期(年)和 中的表达研究结果表明与正常人结肠上皮细胞 相比 在癌细胞中的表达较高(图).接下来检测 和阿霉素联合抑制肿瘤细胞的能力结果显示阿霉素(图)与(图)对 结直肠癌细胞的抑制显示出协同作用(图).相反由于 在正常细胞中低表达所以正常上皮细胞 对联合治疗的敏感性大大减弱(图).此外阿霉素和 的协同作用通过等效线图法得到证实如图 所示.另一种结直肠癌细胞 的结果表明联合效应不是细胞特异性表型(图).和阿霉素单独处理或其组合处理 细胞其典型细胞形态和数量如图 所示.此外联合处理 癌细胞其抑制效果呈时间依赖性如图 所示.为了确认上述数据还进行了克隆形成实验检测.如图 所示相较于阿霉素和 单独处理两者联合对 细胞的抑制更加明显.:检测结直肠癌细胞中 表达情况:和 细胞的药物敏感性测定:药物或抑制剂处理 后 的细胞形态和数量分析:药物或抑制剂对 细胞抑制的时间依赖性分析:药物或抑制剂对 细胞的克隆形成影响分析.图 和阿霉素单独处理或其联合处理对结直肠癌细胞的抗增殖作用 .和阿霉素联合治疗通过激活/通路诱导细胞周期停滞为了探索可能的机制本研究分析了 和阿霉素单独处理或其组合处理 细胞后细胞周期的变化.是一种成熟的细胞增殖标记物通过免疫荧光检测(图)表明在 和阿霉素联合处理 细胞后细胞增殖受到显著抑制.同时使用 细胞增殖检测试剂盒检测细胞的增殖能力与上述结果保持一致(图).为了确认联合治疗是否诱导细胞周期停滞检测了细胞周期蛋白()及相关王源源等:靶向碱基切除修复途径以克服结直肠癌细胞中的阿霉素耐药性的细胞周期蛋白依赖性激酶()的表达结果表明、和 的表达在阿霉素或 单独作用下略有降低但在 和阿霉素联合治疗后显著降低(图).此外为了揭示可能的具体分子机制分析了/的基因表达它是/和视网膜母细胞瘤()通路的关键调节因子.在大多数癌症类型中/被下调以加速癌细胞生长.抑制蛋白/和 的表达升高和 的磷酸化降低也证实了细胞周期受到了抑制(图).表明联合治疗是通过激活/诱导癌细胞中的细胞周期停滞进而抑制癌细胞的增殖.:免疫荧光检测 的表达:免疫荧光检测 的表达:检测细胞周期相关蛋白的表达:免疫荧光检测 的表达:免疫荧光检测 的表达图 和阿霉素单独处理或其组合处理后的细胞周期变化 .和阿霉素联合治疗导致癌细胞中 损伤增加研究分析了用 和阿霉素单独处理或其组合处理后 细胞中的 损伤.蛋白质印迹和免疫荧光的结果显示用 和阿霉素一起处理的 细胞中 表达显著升高表明共同处理导致未修复的 双链断裂()的积累(图).为支持上述数据同时检测了 蛋白的表达结果与上述数据一致(图).为了评估共同治疗对染色体完整性和稳定性的影响分析了中期细胞核的染色体畸变.联合治疗组表现出显著增加的染色体片段和断裂水平(图).上述数据表明 和阿霉素联合会导致癌细胞中未修复的 的积累和染色体断裂.和阿霉素联合治疗促进癌细胞凋亡为了确定 和阿霉素联合治疗是否促进了细胞凋亡用 和 进行双重染色.如图 和 所示单药治疗组仅诱导轻微的细胞凋亡但联合治疗导致细胞凋亡率增多.为了解联合治疗诱导细胞凋亡的机制检测了 细胞中促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的表达.如图 所示 和阿霉素联合处理下调了抗凋亡蛋白 的表达水平同时上调了促凋亡蛋白 的表达.可以增强阿霉素在小鼠体内的抗肿瘤效应为了评估 和阿霉素联合治疗在体内的抗肿瘤效果使用了 异种移植模型.将 细南京师大学报(自然科学版)第 卷第 期(年):检测 水平的表达:免疫荧光检测 的表达:免疫荧光检测 的表达:染色体畸变测定.图 和阿霉素单独处理或其组合处理后对 细胞诱导的 损伤 胞皮下注射到裸鼠的右侧.当肿瘤体积达到 时将小鼠随机分为 组.两周后每两天对荷瘤小鼠腹腔注射溶剂、阿霉素(/)、(/)或联合治疗(/阿霉素/)持续 次监测肿瘤体积 .如图 所示在对照组中观察到肿瘤体积随着时间增加单独使用 或阿霉素导致肿瘤生长有所缓慢而 和阿霉素联合治疗显著抑制了肿瘤的生长此外小鼠的肿瘤大小和重量记录也与上述结果一致(图).为了阐明体内联合治疗的抗肿瘤作用机制进行了免疫组织化学和组织免疫荧光分析结果表明联合治疗组 显著降低说明 和阿霉素