贝莱斯芽孢杆菌HN-2次生代谢产物处理下黄单胞菌%28Xoo%29的转录组分析.pdf

文章编号：1674 7054(2023)04 0389 10贝莱斯芽孢杆菌 HN-2 次生代谢产物处理下黄单胞菌（Xoo）的转录组分析高雪，劳广术，谭峥，方渝凯，刘文波，靳鹏飞，缪卫国（海南大学 植物保护学院/热带农林生物灾害绿色防控教育部重点实验室，海口 570228）摘要：为探究贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezens）菌株 HN-2 正丁醇提取物对黄单胞菌(Xoo)的抑菌机制，分别用菌株 HN-2 正丁醇提取物和杆菌肽处理 12 h 后的 Xoo 进行转录组测序（RNA-seq）并利用 GO 数据库和KEGG 数据库对转录组数据进行分析。转录组数据分析结果表明，HN-2 正丁醇提取物和杆菌肽处理后Xoo 菌内均有大量差异表达基因（DEGs），HN-2 处理组共得到 1 512 个差异表达基因，其中上调表达基因871 个，下调表达基因 641 个；GO 富集分析发现 HN-2 正丁醇提取物处理后，Xoo 的差异表达基因主要聚类在代谢过程、细胞组分、大分子复合物、催化活性等方面；KEGG 聚类分析发现 HN-2 正丁醇提取物处理后，核糖体途径所包含的差异表达基因数目最多，差异最显著，其余主要参与的代谢途径有淀粉和蔗糖代谢、苯甲酸酯降解、甘油磷脂降解、细菌趋化性等。结果表明，HN-2 正丁醇提取物主要影响 Xoo 的核糖体途径、淀粉和蔗糖代谢途径、细菌趋化性途径。关键词：贝莱斯芽孢杆菌；黄单胞菌；抑菌活性；表达差异基因中图分类号：Q 78 文献标志码：A引用格式：高雪，劳广术，谭峥，等.贝莱斯芽孢杆菌 HN-2 次生代谢产物处理下黄单胞菌（Xoo）的转录组分析J.热带生物学报，2023,14（4）：389398.DOI：10.15886/ki.rdswxb.2023.04.006 水稻（Oryza sativa L.）白叶枯病是一种由黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo）引起的细菌性病害，在各水稻种植区均有发生，并且危害严重，是我国水稻重要病害之一1。发病后叶片产生黄绿色病斑，最终变黄枯死，每年造成水稻产量减少 20%30%，严重时减产 50%，甚至绝收2。虽然目前有一些抗病品种，但是抗病性易随着时间而逐渐减弱。防治白叶枯病的化学药剂有铜制剂、有机磷、有机氮、噻唑类等3 8，这些药剂大部分在田间使用时易使病菌产生抗药性，对环境有影响。如噻枯唑在田间已有明显抗性9；5-氧吩嗪类药剂持效期短，病害易复发，水稻白叶枯病的防治形势依旧严峻。生物防治是一种高效且对环境友好的策略，可以用于植物病害的治理10。生防芽孢杆菌是目前应用最广泛的生防细菌之一，对各种真菌、细菌和病毒的侵染造成的植物病害，都能够有效地抑制11，并且还具有良好的促进植物增产、诱导植物抗病的能力。目前，越来越多生防芽孢杆菌被开发成农药，得到商品化产品12。芽孢杆菌能够产生次级代谢物质来抑制和杀灭有害微生物，这些活性代谢物质主要包括酶类、细菌素类，以及受到关注最多的脂肽类等13 14，如地衣形芽孢杆菌（Bacillus licheni formus）可以发酵产生一种具有良好的抑制细菌活性的脂肽类物质杆菌肽。杆菌肽目前作为一种多肽类抗生素已经被广泛地应 收稿日期：2022 04 28修回日期：2022 06 18基金项目：海南省基础与应用基础研究计划（自然科学领域）高层次人才项目（2019RC163）；海南省青年科技英才创新计划（QCXM201903）；国家自然基金地区科学基金项目（31960552）；海南省基础与应用基础研究计划（自然科学领域）高层次人才项目（322RC591）；海南大学校内科研启动经费项目 KYQD(ZR)1842第一作者：高雪（1997），女，海南大学植物保护学院 2019 级硕士研究生.E-mail：通信作者：靳鹏飞（1987），男，副教授.研究方向：微生物生物防治研究.E-mail：；缪卫国（1969），男，教授.研究方向：植物病理学研究.E-mail：M 第 14 卷 第 4 期热 带 生 物 学 报Vol.14 No.42023 年 7 月JOURNALOFTROPICALBIOLOGYJul.2023用于医学15。有研究16表明芽胞杆菌属（Bacillusspp.）能够产生具有较强拮抗 Xoo 的脂肽类活性物质。Bacillus strain D13 可以产生一种挥发性物质，该挥发性物质具有较好的抑制 Xoo 的活性17。解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens FZB42 分泌的抗生素类物质 bacilysin 和 difficidin 对水稻黄单胞菌 Xoo 具有显著的抑菌作用18。笔者所在实验室的研究19发现，贝莱斯芽孢杆菌 HN-2 产生的 C15surfactin A 对 Xoo 具有较强抗菌活性，能抑制 Xoo 的生长，并通过介导抗氧化剂相关酶的活性而引发过敏性反应，有效地诱导水稻对 Xoo 的抗性。虽然目前已经有一些关于芽孢杆菌抑制Xoo 的研究，然而贝莱斯芽孢杆菌抑制 Xoo 的作用机制尚不明确。因此，本研究以 HN-2 菌株发酵液正丁醇提取物处理 12 h 后的 Xoo 为研究对象，进行转录组测序和分析，拟求得 Xoo 应对 HN-2 抑菌活性成分的代谢途径基因表达差异图谱，为后续进一步揭示贝莱斯芽孢杆菌 HN-2 的抑植物病原细菌 Xoo 机理提供前期数据和理论参考。1材料与方法 1.1实验材料及样品准备 贝莱斯芽孢杆菌HN-2 为本实验室从土壤中分离保存，稻黄单胞菌Xoo（PXO99A）由笔者所在的实验室提供保存。杆菌肽（98%，分析纯）购自日本和光纯药株式会社有限公司。（1）HN-2 发酵活性物质的提取：接种HN-2 菌株于 LB 培养基 37，180 rmin1振荡培养 48 h 后，离心 10 min 弃去菌体，得到 HN-2 发酵液上清液。等比例并充分混合正丁醇和 HN-2 发酵上清液后，室温下静置过夜，用分液漏斗分离有机相得到上层正丁醇萃取液。在 67 下将得到的上层正丁醇萃取液进行旋转蒸发浓缩，蒸发浓缩后的沉淀用少量甲醇充分溶解并进行冷冻干燥12 h，得到 HN-2 抑菌活性成分粉末粗提物，80 保存备用，使用前称取 0.01 g 粗提物加入 1 mL的超纯水充分溶解，并用一次性细菌过滤器过滤。（2）样品处理：从平板上挑取黄单胞菌的单菌落接种至 PSA 液体培养基中，共接种 9 瓶，在 28，180 rmin1振荡培养至生长对数期（OD600=0.300）。此时向第一组菌液中加入 HN-2 正丁醇提取物至终浓度为 MIC50值（2.36 mgmL1），第二组菌液加入杆菌肽至终浓度为 MIC50值（11.96mgmL1），第三组菌液不做任何处理，继续振荡培养 12 h，3 次重复，将 HN-2 正丁醇提取物处理 12 h的样品命名为“Xoo-HN-2”，杆菌肽处理 12 h 的样品命名为“Xoo-G”，对照组命名为“Xoo-CK”。1.2转录组测序和生物信息学分析 样品Xoo 总 RNA 的提取使用天根 RNA 提取试剂盒，并将提取的 RNA 送到广州基地奥生物科技公司进行质检，以保证所有样品最终都获得高质量的总 RNA。利用 Illumina HiSeq X Ten 测序平台（Illumina Inc,CA,USA）进行转录组建库测序及分析。步骤：（1）去除核糖体 RNA；（2）RNA 随机打断为 200 nt 片段；（3）加入六碱基随机引物、缓冲液、dNTPs、RNase H 和 DNA 聚 合 酶 合 成cDNA 第一条链；（4）使用 dUTP 代替 dTTP，合成cDNA 第二条链；（5）末端修复 3、5端，加 A 尾，连接接头；（6）使用 UNG 酶降解 cDNA 第二条链，以保留 RNA 方向信息；（7）PCR 扩增产生 DNA 的聚集片段，完成文库制备；（8）利用 Illumina 测序平台对构建好的文库进行双末端测序，将所得数据过滤后用于后续的转录组分析20。1.3差异基因表达分析 对样品中的 Mappedreads 数目和转录本长度进行归一化处理，使用RAEM 软件，采用 FPKM（Fragments Per Kilobaseof transcript per Million fragments mapped）作为衡量转录本的指标21，采用皮尔森相关系数（PearsonCorrelation Coefficient，PCC）法检测重复样品之间的相关性，并利用 DESeq R 包分析不同处理后 Xoo的差异表达基因。为进一步控制该过程中的错误发现率（false discovery rate，FDR），使用 edgeR22软件对不同样品间差异表达基因定量分析。采用 FDR（false discovery rate）与 log2(FoldChange)（log2FC）来作为差异表达基因筛选的关键指标，筛选条件为 FDR1。1.4基因功能富集分析 将筛选得到的差异基因进行 GO 富集分析，用特定的 GO terms 给差异表达基因的表达模式注释；利用 KEGG 数据库找出在差异表达基因中，富集最显著的前 20 条代谢通路画图展示。2结果与分析 2.1RNA-seq 数据质控结果 转录组原始数据质控过滤前后的黄单胞菌 Xoo（PXO99A）转录组390热 带 生 物 学 报2023 年测序数据统计情况见表 1。由表 1 可见，CK 组、HN-2 组、杆菌肽组的样本通过测序获得的原始碱基数（Raw Data）分别为3 669 218 400、3 356 470 200和 5 089 554 000。3 组原始序列经过质控后获得的 Clean data 分别为 3 490 096 417、3 232 110 301和 502 049 243。过滤后的总碱基数占原始序列的比例分别为 98.55%、98.53%和 97.32%，Q20 分别为98.03%、98.03%和97.32%，Q30 分别为94.89%、94.89%和 92.0%，GC 含量分别为 61.61%、61.06%和 60.93%，这些结果表明过滤后所获得的序列质量较好，可靠性高，Clean reads 可以用于后续的生物信息学分析。表1Reads 过滤前后碱基信息统计结果样品碱基信息样本名Xoo-CKXoo-HN-2Xoo-G过滤前Raw data/bp3 669 218 4003 356 470 2005 089 554 000Q20/%3 596 827 023(98.03%)3 293 722 095(98.03%)4 948 281 317(97.22%)Q30/%3 481 614 115(94.89%)3 188 133 592(94.98%)4 674 417 659(91.84%)N/%5 182(0.0%)4 797(0.0%)41 169(0.0%)GC/%2 260 575 649(61.61%)2 049 438 853(61.06%)3 095 193 280(60.82%)Clean data/bp3 490 096 4173 232 110 3015 020 492 431过滤后Q20/%3 439 489 923(98.55%)3 184 723 700(98.53%)4 886 066 551(97.32%)Q30/%3 336 281 653(95.59%)3 087 417 164(95.52%)4 618 772 865(92.0%)N/%4 928(0.0%)4 619(0.0%)40 606(0.0%)GC/%2 158 506 542(61.85%)1 978 705 819(61.22%)3 059 001 170(60.93%)注：Raw data：原始下机数据碱基总数（bp）；Clean data：过滤低质量reads后获得的有效数据碱基总数及占raw data的百分比；Q20（%）：测序碱基正确率