蝉虫草及其寄生真菌产生免疫抑制剂多球壳菌素能力的鉴定.pdf

2023 年第 57 卷第9 期 Shanghai J Tradit Chin Med，Vol.57，No.9，Sept.2023 上海中医药杂志蝉虫草及其寄生真菌产生免疫抑制剂多球壳菌素能力的鉴定章安安，贺庆利上海中医药大学创新中药研究院手性药物研究中心（上海 201203）【摘要】目的寻找能产生免疫抑制剂多球壳菌素（myriocin）的蝉虫草或其寄生真菌。方法选取蝉虫草原药材大蝉草和蝉花干燥品，蝉花寄生真菌蝉棒束孢菌（Cordyceps cicadae或Isaria cicadae Miq.BNCC114807）以及一种线虫草属蝉寄生真菌Ophiocordyceps sp.FU30231，通过聚合酶链式反应（PCR）法扩增内源转录间隔区（ITS）序列，鉴定各材料的菌种；分别以乙醇回流提取法和80%甲醇浸提法制备虫生真菌发酵液，并进行液相色谱-质谱（LC-MS）分析；以多球壳菌素标准品为对照，寻找生产多球壳菌素的虫生真菌；通过大量发酵和分离鉴定多球壳菌素，最终确定其产源虫生真菌。结果ITS序列分析表明，蝉虫草原药材大蝉草和蝉花的寄生真菌分别为奇异弯颈霉（Tolypocladium paradoxum）和蝉棒束孢菌。提取液LC-MS分析结果表明，仅Ophiocordyceps sp.FU30231中检测到多球壳菌素的产生。大量发酵并分离纯化后，采用核磁谱鉴定确证了Ophiocordyceps sp.FU30231产多球壳菌素的能力。结论Ophiocordyceps sp.FU30231首次被鉴定为免疫抑制剂多球壳菌素的生产菌株。【关键词】蝉虫草；虫生真菌；免疫抑制剂；多球壳菌素；免疫疾病Identification of ability of Cordyceps and its parasitic fungi to produce immunosuppressant myriocinZHANG Anan，HE QingliResearch Center for Chiral Drugs，Innovative Institute of Chinese Pharmacy，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，ChinaAbstract：ObjectiveTo identify the source of immunosuppressant myriocin from Cordyceps and its parasitic fungi.MethodsDried raw materials of traditional Chinese medicine，Dachancao and Chanhua，and two parasitic fungi of cicada，Cordyceps cicadae（or Isaria cicadae Miq.BNCC114807）and Ophiocordyceps sp.FU30231，were selected as potential myriocin producing sources.Polymerase chain reaction（PCR）was applied to obtain internal transcribed space（ITS）sequences of strains of all materials.The fermentation broth of entomogenous fungi was prepared by ethanol-reflux extraction and 80%methanol extraction，respectively，and analyzed by LC-MS.The entomogenous fungi producing myriocin were identified by using myriocin as a control standard.After extensive fermentation and isolation of myriocin，the source of myriocin was finally confirmed.ResultsITS sequences analysis showed that the parasitic fungi of Dachancao and Chanhua were Tolypocladium paradoxum and Cordyceps cicadae，respectively.The results of LC-MS analysis of the extracts indicated that the production of myriocin was detected only in the extract of Ophiocordyceps sp.FU30231.After massive fermentation，isolation and purification，the ability of Ophiocordyceps sp.FU30231 to produce myriocin was confirmed by NMR spectrum.ConclusionFor the first time，Ophiocordyceps sp.FU30231 was identified as the immunosuppressant myriocin-producing fungus which parasitized on cicada.Keywords：cordyceps；entomogenous fungi；immunosuppressant；myriocin；immune disease多球壳菌素（myriocin）最早于1972年从嗜热真菌无 孢 菌 群（Mycelia sterilia）和 白 球 菌（Myriococcum albomyces）中以抗真菌活性成分筛选的方式被分离鉴定1-2。1994年，来自日本的研究团队Fujita等3从蝉虫草寄生真菌辛克莱棒束孢（Isaria sinclairii）中重新分离鉴定了多球壳菌素，并通过小鼠异体混合淋巴细胞反应实验（MLR）和大鼠皮肤移植实验（RSG）发现其具有510倍于环孢菌素A的强免疫抑制活性。然而，由于DOI：10.16305/j.1007-1334.2023.2305081创 新 中 药 与 经 典 名 方 专 栏基金项目 国家自然科学基金项目（22177075）作者简介 章安安，男，硕士研究生，主要从事中药活性分子的生物合成研究工作通信作者 贺庆利，博士，研究员；E-mail：11上海中医药杂志 2023 年第 57 卷第9 期 Shanghai J Tradit Chin Med，Vol.57，No.9，Sept.2023 多球壳菌素同时还具有较强的毒性，所以该团队通过对其进行结构优化改造，并对改造物进行构效分析4-8，得 到 了 毒 性 大 大 降 低 但 活 性 相 当 的 芬 戈 莫 德（Fingolimod）。该化合物已经成药，主要用于免疫疾病复发型多发性硬化症的治疗。2004年，继蝉虫草寄生真菌辛克莱棒束孢被发现产多球壳菌素之后，在另一种蝉虫草寄生真菌异足虫草（Cordyceps heteropoda）中也分离鉴定到了多球壳菌素9-10。此外，人工培育的长座线虫草（Ophiocordyceps longissima）中也被分离鉴定出多球壳菌素11。由于多球壳菌素具有极为显著的免疫抑制活性，且虫草类中药具有抗衰老、抗肿瘤和免疫调节等药理作用12-16，冬虫夏草、蛹虫草、亚香棒虫草和蝉花等常见虫草类中药及其寄生真菌开始被争相报道含有多球壳菌素17-22。然而，一些研究23-24则表明，这些常见虫生真菌中可能根本不含有多球壳菌素。因此，当前多球壳菌素的产源虫生真菌存在明显争议，而对多球壳菌素产源真菌的进一步确定和拓展将有利于其未来在各个领域的开发利用。蝉虫草类中药是传统的名贵药材，是由不同种类的蝉若虫虫体与不同的昆虫病原性虫生真菌子实体组成的干燥复合体。当前，全世界约有30种虫生真菌被报道能够侵染蝉若虫形成蝉虫草，仅我国就有15种9。这些蝉虫草在形态上具有一定的相似性，因而民间常误将它们全部作为商品蝉花使用，这使得蝉虫草类中药使用的安全性成为令人关注的问题。此外，长期以来不同学者对于蝉虫草寄生真菌的分类学地位和名称存在较大争议，不同文献对于同种虫生真菌的命名常出现“同种异名”的现象，比如商品蝉花的寄生真菌的命 名 长 期 存 在 Cordyceps cicadae、Isaria cicadae 和Paecilomyces cicadae三者共存的现象，这为多球壳菌素产源真菌的寻找和鉴定带来一定的困难。本课题旨在通过对大蝉草和蝉花原材以及蝉花寄生真菌和一种线虫草属蝉生真菌的菌种鉴定，结合其代谢产物的液相色谱-质谱（LC-MS）测定，以及多球壳菌素的分离鉴定，最终鉴定多球壳菌素的产源蝉虫草寄生真菌，从而为多球壳菌素的制备提供借鉴，为其生物合成研究提供确切的物种材料，进而为多球壳菌素产源真菌争议乃至蝉虫草寄生真菌的药食两用安全性等问题的解决提供一定的参考。1材料与方法1.1材料1.1.1蝉虫草与虫生真菌干燥蝉花来源于浙江台州；干燥大蝉草来源于江苏徐州。蝉花寄生真菌菌株Cordyceps cicadae 或 Isaria cicadae Miq.BNCC114807，购自北纳创联生物科技有限公司；线虫草属真菌菌株Ophiocordyceps sp.FU30231，购自中国台湾食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心。1.1.2药物与试剂多球壳菌素标准品（纯度98%），上海源叶生物科技有限公司（批号：S46411-1）；NKA非极性大孔树脂，索莱宝生物科技有限公司（批号：AC12952-500）；2 Taq DNA Master Mix，南京诺唯赞生物科技股份有限公司（批号：P111-01）；DNA胶回收试剂盒，美国 OMEGA Bio-Tek公司（批号：D6943-02）；酵母膏（Yeast Extracts），美国Oxoid公司（批号：LP0021）。实验用试剂包括无机盐、分析纯乙醇、甲醇、色谱纯乙腈、氘代甲醇等，除特殊说明或另外指出，均购自上海泰坦科技股份有限公司；实验用生化试剂如真菌培养与发酵培养基配制用葡萄糖、多聚蛋白胨、牛肉蛋白胨以及聚合酶链式反应（PCR）与测序用引物等，除特殊说明或另外指出，均购自上海生工生物技术有限公司。1.1.3主要仪器NanoDrop One超微量紫外分光光度计，美 国 Thermo Fisher Scientific 公 司（型 号：840-317400）；PCR 扩增仪，美国 Thermo Fisher Scientific 公司（型 号：ProFlexTMBas）；台 式 常 温 离 心 机，德 国Eppendorf公司（型号：Centrifuge 5245）；高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司（型号：Centrifuge 5910R）；高温灭菌器，日本普和希株式会社（型号：MLS-3751L-PC）；超净台，北京东联哈尔仪器制造有限公司（型号：DL-CJ-1NDII）；凝胶成像，上海勤翔科学仪器有限公司（型号：GenoSens 1850）；高通量组织研磨仪，上海万柏生物科技有限公司（型号：Wonbio-48r）；DNA凝胶电泳仪，北京六一生物科技有限公司（型号：JY300C）；旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司（型号：R206）；大容量振荡培养箱，上海西雷生物科技有限公司（型号：YR101）；隔水式恒温培养箱，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司（型号：GSP-9080MBE）；低分辨液质联用，日本Shimadzu公司（型号：LCMS