白藜芦醇对ZEN诱导的猪小肠上皮细胞损伤的作用效果研究.pdf

第 30 卷 第 3 期 天 津 农 学 院 学 报 Vol.30，No.3 2023 年 6 月 Journal of Tianjin Agricultural University June，2023 收稿日期：2022-04-25 基金项目：天津市大学生创新创业计划训练项目（202110061048）；天津市生猪产业技术体系创新团队（ITTPRS2023006）作者简介：韩婧娥（1998），女，硕士在读，研究方向为临床兽医学。E-mail：。通信作者：秦顺义（1979），男，副教授，博士，主要从事动物营养代谢病与中毒病方面研究。E-mail：。文章编号：1008-5394（2023）03-0047-06 DOI：10.19640/ki.jtau.2023.03.009 白藜芦醇对 ZEN 诱导的猪小肠上皮细胞损伤的作用效果研究 韩婧娥，王欢欢，李鹏程，佘福泽，黎肖昱，秦顺义通信作者（天津农学院 动物科学与动物医学学院 天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津 300392）摘 要：试验旨在探究白藜芦醇对玉米赤霉烯酮（ZEN）诱导的猪小肠上皮细胞（IPEC-J2 细胞）损伤的影响。试验分组为：C 组（对照组）、Z 组（ZEN 浓度 25 g/mL）、ZR1 组（25 g/mL ZEN10 mol/L 白藜芦醇）、ZR2 组（25 g/mL ZEN20 mol/L 白藜芦醇）、ZR3 组（25 g/mL ZEN30 mol/L 白藜芦醇）；测定细胞活力、细胞乳酸脱氢酶（LDH）活性、抗氧化酶水平以及Caspase 3、Caspase 9、Bcl-2和bax等凋亡相关基因 mRNA 表达水平。试验结果显示：Z 组细胞活力、SOD 活性 T-AOC 水平和Bcl-2基因 mRNA 表达水平极显著低于 C 组（P0.01），ZR2 组和 ZR3 组细胞活力、SOD 活性、T-AOC 水平和Bcl-2基因 mRNA 表达水平极显著或显著高于 Z 组和 ZR1 组（P0.01 或P0.05）；Z 组细胞 LDH 活性、MDA 水平、Capase-3、Capase-9和Bax基因 mRNA 表达水平极显著高于 C 组（P0.01），ZR2 组和 ZR3 组细胞 LDH 活性、MDA 水平、Capase-3、Capase-9和Bax基因 mRNA 表达水平极显著或显著低于 Z 组和 ZR1 组（P0.01 或P0.05），ZR1 组细胞LDH 活性和Bax基因 mRNA 表达水平极显著低于 Z 组（P0.01）。结果表明，白藜芦醇能够缓解ZEN 诱导的 IPEC-J2 细胞的细胞活力、LDH 活性、抗氧化功能和凋亡相关基因 mRNA 表达水平的改变。关键词：白藜芦醇；玉米赤霉烯酮；猪小肠上皮细胞；细胞活力；乳酸脱氢酶活性；抗氧化功能；凋亡基因 中图分类号：S816.7 文献标识码：A Effects of resveratrol on zearalenone induced injury of porcine intestinal epithelial cells Han Jinge,Wang Huanhuan,Li Pengcheng,She Fuze,Li Xiaoyu,Qin Shunyi Corresponding Author（Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry,College of Animal Science and Veterinary Medicine,Tianjin Agricultural University,Tianjin 300392,China）Abstract:The purpose of this study was to investigate the effect of resveratrol on the injury of porcine small intestinal epithelial cells（IPEC-J2 cells）induced by zearalenone（Zen）.The experimental groups were:Group C（control group）,group Z（25 g/mL Zen）,group ZR1（25 g/mL Zen10 mol/L resveratrol）,group ZR2（25 g/mL Zen20 mol/L resveratrol）,group ZR3（25 g/mL Zen30 mol/L resveratrol）.The cell viability,the activity of lactate dehydrogenase（LDH）,the level of antioxidant enzymes and the mRNA expression of apoptosis related genes such as caspase 3,caspase 9,Bcl-2 and Bax were measured.The results showed that the cell viability,SOD activity,T-AOC level and Bcl-2 gene mRNA expression level in group Z were significantly lower than those in group C（P0.01）.The cell viability,SOD activity,T-AOC level and Bcl-2 gene mRNA expression level in group ZR2 and ZR3 were significantly higher than those in group Z or group ZR1（P0.01 or P0.05）.The LDH activity,MDA level,Capase-3,Capase-9 and Bax gene mRNA expression levels in group Z were significantly higher than those in group C（P0.01）.The LDH activity,MDA level,Capase-3,Capase-9 and Bax gene mRNA expression levels in group ZR2 and ZR3 were lower or significantly lower than those in group Z or group ZR1（P0.01 or P0.05）.The LDH activity and Bax gene mRNA expression levels in ZR1 group were lower than those in group Z（P0.01）.The results indicated that resveratrol could alleviate the changes of cell viability,LDH activity,antioxidant function and apoptosis related gene mRNA expression of IPEC-J2 cells induced by Zen.Key words:resveratrol;zearalenone;porcine intestinal epithelial cells;cell viability,lactate dehydrogenase activity;antioxidant function;apoptosis gene 玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是镰刀菌属产生的真菌毒素，广泛存在于各种粮食作物与饲料原料中1-2。ZEN 主要表现为生殖毒性，同时也会产生免疫毒性、细胞毒性及氧化损伤等毒 天 津 农 学 院 学 报 第 30 卷 48性3-4；ZEN 的细胞毒性可造成细胞的氧化损伤，并抑制细胞增殖5。白藜芦醇是从植物中提取的非黄酮类多酚化合物，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、调节能量代谢、调节肠道、调节免疫等作用6。文献报道具有抗氧化特性的多种物质均对ZEN 具有拮抗效果7-9，但未见将白藜芦醇应用于缓解 ZEN 对肠道的毒性作用研究。本项目研究白藜芦醇对 ZEN 诱导的猪肠上皮细胞损伤的作用效果，旨在为缓解 ZEN 危害提供新方法。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞 猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）细胞系（天津市畜牧兽医研究所馈赠）。1.1.2 主要试剂与仪器 玉米赤霉烯酮（上海源叶生物科技有限公司），CCK8 检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司），丙二醛（MDA）检测试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒、总抗氧化能力（T-AOC）检测试剂盒（南京建成生物技术研究所），cDNA 试剂盒、SYBR Green qPCR Mix（Genecopoeia 公司）。iMark 酶标仪、CFX96 荧光定量 PCR 仪（BIO-RAD 公司）。1.2 方法 1.2.1 白藜芦醇对 ZEN 诱导的 IPEC-J2 细胞活力测定 将细胞含量调至 105个/mL，以每孔 100 L 接种于 96 孔板中，当细胞长至 70%时，开始试验。试验分为 5 组：C 组（对照组）、Z 组（ZEN 浓度25 g/mL）、ZR1 组（25 g/mL ZEN10 mol/L 白藜芦醇）、ZR2 组（25 g/mL ZEN20 mol/L 白藜芦醇）、ZR3 组（25 g/mL ZEN30 mol/L 白藜芦醇），每组重复 4 次。C 组和 Z 组使用普通培养液，ZR1 组、ZR2 组、ZR3 组分别使用含白藜芦醇 10 mol/L、20 mol/L 和 30 mol/L 的培养液，置于细胞培养箱中培养 6 h 后，向 Z 组、ZR1 组、ZR2组、ZR3 组加入 ZEN 使其浓度为 25 g/mL，继续培养 24 h 后，各孔均加入 CCK8 10 L，于培养箱中继续孵育 1 h 后，用酶标仪在 450 nm 处测定各孔吸光度，计算细胞活力：细胞活力（%）（OD试验OD空白对照）/（OD阴性对照OD空白对照）100%。1.2.2 白藜芦醇对 ZEN 诱导的 IPEC-J2 细胞培养液上清中 LDH 活性测定 试验分组及处理同1.2.1。细胞培养结束后，收集细胞培养上清液，利用乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒测定各孔 LDH 活性；计算公式为：LDH 活性（U/L）（OD测定OD对照）/（OD标准OD空白）0.21 000。1.2.3 白藜芦醇对 ZEN 诱导的 IPEC-J2 细胞抗氧化酶水平测定 将细胞含量调至 106个/mL，以每孔 2 000 L接种于 6 孔板中，当细胞长至 70%时，开始试验。试验分组及处理同 1.2.1。细胞培养结束后，转移细胞至 EP 管中，加入预先冷却的细胞裂解液，低温超声波破碎细胞后，离心、取上清测定细胞 SOD、T-AOC 和 MDA 的水平。1.2.4 白藜芦醇对 ZEN 诱导的 IPEC-J2 细胞凋亡相关基因 mRNA 表达水平测定 依据 GenBank 中猪肠上皮细胞-actin、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2和bax基因的参考序列，采用 Primer 3 进行引物设计，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物信息见表 1。细胞分组及处理同 1.2.3，细胞培养结束后，常规提取总 RNA，利用 First-Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒反转录合成 cDNA；然后用荧光定量PCR 仪检测白藜芦醇对 ZEN 诱导的